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第40卷第6期41卷第3期
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               ·340 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2020年6月年3月
                                                                                                   2021

              胞 分 化 抗 原 109（cluster of differentiation 109，     1.2.2  免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）
              CD109）是一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，属于α2⁃                        染色
              巨球蛋白/补体家族的成员。CD109 是转化生长因                              组织芯片（tissue microarrays，TMA）由江南大学
              子⁃β（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）的协同受       附属口腔医院病理科制作。所有组织标本均采用
              体，可调节 TGF⁃β受体的内吞和降解，从而抑制                          10%中性缓冲福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋。
                            ［2］
              TGF⁃β信号通路 。CD109 对 TGF⁃β信号通路的调                    从供体蜡块中收取组织芯柱（直径2 mm），并将其置
              节很可能影响肿瘤的发生发展 。本研究通过检测                            于石蜡中，制成新的组织包埋块，4 μm 切片。采用
                                         ［3］
              口腔组织中 CD109 的表达，探究 CD109 表达对 OS⁃                  SP 法对口腔 TMA 样本进行 IHC 染色，一抗使用兔
              CC 患者临床病理特征和预后的关系，为OSCC 预后                        抗人CD109多克隆抗体（1∶200），详细步骤参见His⁃
              提供新的生物标志物。                                        tostain SP 免疫组化染色试剂盒说明书。IHC 染色
                                                                结果由两名病理医生在双盲情况下评估。根据
              1  材料和方法
                                                                CD109 染色强度对样本组织中的细胞染色进行评
              1.1  材料                                           分，分别为 0 分（阴性）、1 分（弱阳性）、2 分（中阳
                  口腔组织取自 2014 年 1 月—2017 年 12 月在江               性）、3（强阳性）。最终染色评分=［3×强染色百分比+
              南大学附属医院口腔科接受手术或活检的118例患                           2×中度染色百分比+1×弱染色百分比］×100。最终染
              者。口腔组织标本包括OSCC组织118例，癌旁组织                         色评分范围从0（无染色）到300（100%细胞染色强阳
              32例。样本采集前患者均未接受放化疗。男76例，                          性）。根据OSCC患者的生存预后情况，使用Xtile软
              女42例，中位年龄34.5岁（范围39~74岁）。临床资                      件（http：//www.tissuearray.org）将 CD109 表达情况分
              料来源于患者病历，根据第 8 期美国癌症联合委员                          为高表达和低或无表达，计算出cutoff值为115。
              会（Alternate Joint Communications Center，AJCC）癌    1.3  统计学方法
              症分期手册确定OSCC的疾病临床分期。本研究通                                所有数据均采用 SPSS 18.0 统计软件包进行分
              过江南大学附属医院伦理委员会的批准，并获得所                            析。计量资料以均值±标准差（x ± s）表示，两独立研
              有患者的书面同意。                                         究组间均数的比较采用成组t检验。对例数和率的
                  TRIzol试剂、SuperScript Ⅳ First⁃Strand试剂盒、       比较采用 Pearson 卡方检验计算 CD109 与临床病理
              SYBR 荧光定量 PCR 试剂盒（Thermo 公司，美国），                  特征的相关性。采用Kaplan Meier 法分析累计生存
              兔抗人CD109多克隆抗体（Abcam公司，英国），His⁃                    率。建立 Cox 比例风险回归模型，进行单因素和多
              tostain 链霉菌抗生物素蛋白⁃过氧化物酶（streptavi⁃                因素分析，先进行单因素分析，对P < 0.01的因素再
              din⁃perosidase，SP）免疫组化染色试剂盒和苏木素染                  进行多因素分析，确定预后因素。P＜0.05 为差异
              料（北京中杉金桥生物科技有限公司），二氨基联苯                           有统计学意义。
              胺（武汉纯度生物科技有限公司）。引物由南京金
                                                                2  结 果
              斯瑞生物有限公司合成。
              1.2  方法                                           2.1  CD109 mRNA在OSCC组织中高表达
              1.2.1  实时定量聚合酶链反应（quantitative real⁃                   采用 qRT⁃PCR 检测 25 例 OSCC 组织及对应癌
              time polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）           旁组织中 CD109 mRNA 的表达水平。结果显示，
                  使用 TRIzol 试剂提取冷冻组织中的总 RNA，使                   OSCC 组织中 CD109 mRNA 的表达量显著高于癌旁
              用 SuperScript Ⅳ First⁃Strand 试剂盒将 RNA 逆转录         组织（P＜0.05，图1）。

              为 cDNA。使用 SYBR 荧光定量 PCR 试剂盒和 ABI                  2.2  CD109蛋白在OSCC组织中高表达
              Prism 7500HT序列检测系统进行定量扩增。引物序                           IHC 检测 CD109 蛋白在 OSCC 组织和口腔癌旁

              列如下：CD109上游5′⁃AAGCCAGTGAAAGGAGAC⁃                 组织中的表达。结果显示，定位于细胞膜的 CD109
              GTA⁃3′，下游 5′⁃CCAGGGGAAGATAGATCCAGG⁃               在 OSCC 组织中高表达（图 2），OSCC 组织中 CD109
              3′，GAPDH 上游5′⁃CTGGGCTACACTGAGCACC⁃3′，             的 高 表 达 率 为 59.32%（70/118），高 于 癌 旁 组 织
              下 游 5′ ⁃ AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG ⁃ 3′ 。 以           （18.75%，6/32）（表1）。
              GAPDH为参照基因，计算CD109 mRNA相对表达量                      2.3 OSCC中CD109表达与临床特征的相关性
              2 -ΔΔCt 。以上实验重复3次。                                     分析OSCC组织中CD109表达与病理参数的相
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