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第41卷第3期         周阳春，章 静，朱 峰. 水通道蛋白3参与缺氧介导的结直肠癌化疗耐药的机制研究［J］.
                  2021年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（03）：344-348                       ·345 ·


                                                  ［2］
                疗、化学药物治疗以及分子靶向治疗等 ，而肿瘤细                           2 mL无抗生素的培养基，混匀，置于37 ℃、5％CO2培
                胞对化疗不敏感常导致CRC治疗失败，严重影响患                           养箱培养，1 d 后进行干扰实验。20 μmol/L siRNA
                者预后 。因此，深入研究CRC化疗耐药机制，降低                          10 μL加至250 μL不含血清的Opti⁃MEM培养基，轻
                      ［3］
                CRC对化疗药物的耐药性，对提高CRC患者的预后                          轻 混 匀 ，室 温 孵 育 5 min。 5 μL 的 Lipofectamine
                具有十分重要的意义。                                        2000 加至 250 μL 不含血清的 Opti⁃MEM 培养基，轻
                    缺氧是实体肿瘤微环境的主要特征，且是肿瘤                          轻混匀，室温孵育 5 min。再将两种悬液轻轻混合，
                预后的独立危险因素 。缺氧可导致肿瘤细胞生物                            室温孵育20 min。将上述混合液加入到1.5 mL无抗
                                   ［4］
                学行为变化，诸如细胞存活、代谢重组、血管生成、基                          生素培养基中，培养细胞24 h后，弃去上层液体，更
                因组稳定性的改变        ［5-7］ 。越来越多的研究发现缺氧参               换新鲜培养基，继续培养48~96 h。
                与肿瘤化疗耐药的产生，然而其机制仍不清楚                   ［8-10］ 。   1.2.3 实时荧光定量PCR实验
                    水通道蛋白 3（aquaporin 3，AQP3）是水通道蛋                    采用TRIzol试剂提取细胞RNA，利用RNA逆转
                白家族成员之一，具有介导渗透压依赖性跨生物膜                            录试剂盒逆转成 cDNA，实时荧光定量 PCR 检测
                水转运的作用，对 H2O2、甘油等小分子物质亦具有                         AQP3 mRNA 表达水平变化。相关引物序列：AQP3
                通透性   ［11-13］ 。诸多研究发现 AQP3 参与肿瘤化疗耐                上游引物 5′⁃CCGTGACCTTTGCCATGTG⁃3′，下游引
                药 ［14-16］ 。文献研究证实CRC组织AQP3表达显著上                   物 5′⁃CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA⁃3′；HIF⁃1α
                调，且促进 CRC 细胞增殖、迁移           ［17］ ，但 AQP3 是否参      上游引物 5′⁃TAGCCGAGGAAGAACTATGAAC⁃3′，
                与 CRC 化疗耐药尚不清楚。Hoogewijs 等           ［18］ 发现缺     下 游 引 物 5′ ⁃ CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTA ⁃ 3′ ；
                氧可上调纤维肉瘤 L929 细胞 AQP3 表达；然而缺氧                     GAPDH 上 游 引 物 5′ ⁃ CGCTGAGTA CGTCGTG⁃
                是否可以上调CRC中AQP3表达尚不清楚。我们前                          GAGTC⁃3′，下游引物 5′⁃GCTGATGATCTTGAGGCT⁃
                期研究发现缺氧可上调 HCT116 和 HT29 细胞中                      GTTGTC⁃3′。每组实验重复 3 遍。PCR 扩增条件：
                AQP3表达，因此推测缺氧可能通过AQP3介导CRC                        95 ℃ 30 s 预变性，95 ℃ 6 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。
                化疗耐药。                                             在 AB17300 系统中检测目的基因和相应内参的 Ct
                                                                  值，每组实验重复3遍。
                1  材料和方法
                                                                  1.2.4 Western blot实验
                1.1  材料                                               BCA 法测定细胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋
                    人 CRC 细胞系 HCT116、HT29 细胞（中国科学                 白质用 SDS⁃PAGE 法分离，并转移至 PVDF 膜上，加
                院上海细胞库）；5⁃Fu（Sigma 公司，德国）；转染试剂                    单克隆抗体于 4 ℃下过夜孵育，TBST 洗去一抗，加
                Lipofectamine2000、TRIzol 试剂（Invitrogen 公司，美       二抗于室温孵育2 h，TBST洗去二抗，洗涤后以ECL
                国）；RNA 逆转录试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；HIF⁃                  试剂盒显示免疫印迹条带，以GAPDH作为内参。
                1α⁃siRNA、AQP3⁃siRNA（上海吉凯基因）；AQP3 抗                1.2.5 细胞活力实验
                体（Santa Cruz 公司，美国）；HIF⁃1α抗体、GAPDH 抗                  CCK⁃8检测细胞活力。96孔板每孔加入1×10 个
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                体（CST公司，美国）；BCA试剂盒、抗兔或抗鼠二抗、                       细胞，37 ℃ 温箱培养，24 h 后加入 0、20、40、60、80、
                细胞活性 CCK⁃8 检测试剂盒（杭州碧云天公司）。                        100 μg/mL 5⁃Fu 作用 24 h，每组均设置 3 个平行样。
                RPMI1640 培养基、Opti⁃MEM 培养基（Life Technolo⁃          每孔加入 10 μL CCK⁃8 试剂，在细胞培养箱中继续
                gies公司，美国）。                                       孵育2 h，再用酶标仪检测，检测波长450 nm。

                1.2  方法                                           1.2.6 平板克隆形成实验
                1.2.1 细胞培养                                            平板克隆形成实验评价细胞集落形成能力，将

                    HCT116、HT29 细 胞 加 入 RPMI1640 培 养 基 +          1 000 个细胞种植于 6 孔板中，培养 14 d 后，用甲醛
                10%胎牛血清，加入 100 U/mL 的青霉素和 100 mg/L                固定结晶紫染色后计数进行评价。
                的链霉素，于 37 ℃、5% CO2恒温孵箱中常规培养。                      1.3  统计学方法
                缺氧条件下细胞培养是将细胞置于密封缺氧箱内                                 采用 SPSS 20.0 软件处理分析实验数据。计量
               （含有1% O2 ）。                                        数据以均数±标准差（x ± s）表示。两组独立数据采
                1.2.2 RNA干扰实验                                     用t检验分析组间差异；多组数据（同一研究对象在
                    取对数生长 2×10 个细胞接种于 6 孔板，加入                     不同时间点的测量数据）采用重复测量方差分析总
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