Page 44 - 南京医科大学学报自然科学版
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第
                                                                                                  第40卷第6期41卷第3期
                                                                                                   2021
               ·350 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2020年6月年3月

                  肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我          1.2  方法
              国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居恶性肿瘤                            1.2.1  临床标本的 GPC3 免疫组化及 miR⁃202 的
              的前列。肝癌呈快速进展、早期转移、化疗抵抗的                            qRT⁃PCR检测
              特点，很多患者确诊时已失去手术机会，预后很                                  手术标本在癌组织、距癌组织边缘3 cm以外的
              差。因此，研究 HCC 发生发展分子机制，探寻 HCC                       癌旁组织取材，经甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，
              诊断治疗的分子靶标，对改善患者的预后有十分积                            用于免疫组织化学检测。鼠抗人GPC3单抗及SP试
              极的意义。磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（glypican⁃3，                      剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。GPC3
              GPC3）蛋白是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋                          单抗工作浓度1∶100，每张切片放大200倍计数5个

              白，通过糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白（glycosyl⁃phos⁃                   视野的阳性细胞数，根据阳性细胞在全部癌细胞中
                                                         ［1］
              phatidylinositol anchor，GPI）连接到细胞膜表面 。            所占比例以及阳性细胞染色强度来计分。按阳性
              锚定到细胞表面的 GPC3 是细胞与细胞、细胞与细                         细胞数计分，无阳性细胞为 0 分，阳性细胞数<1/3、
              胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分相互作用              1/3~<2/3、≥2/3分别计为1、2、3分；按细胞染色强度
              的关键糖蛋白，具有强大的与蛋白质、糖类等功能                            计分，无染色为0分，浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计
              性生物大分子结合的潜力，尤其是结合多种细胞生                            为 1、2、3 分。两项分值相加，积分 0 分判断为（-），
              长因子，包括血管内皮生长因子、表皮细胞生长因                            1~2分为（+/-），3~4分为（+），5~6分为（++）。积分≥
              子、肝细胞生长因子、纤维细胞生长因子、转化生长                           3分的患者为阳性病例。
              因子⁃β等。GPC3 与多种生长因子结合形成受体信                              64例HCC患者术前血清样本及20例健康人对
              号转导复合物，激活生长因子受体的酪氨酸激酶                             照血清样本，经TRIzol LS试剂盒（Thermo Fisher公
                                                                                    TM
              活性，从而调节细胞的生长、分化、黏附、增殖和迁                           司，美国）裂解提取总RNA，采用qRT⁃PCR检测miR⁃
              移 ［2- 3］ 。本课题组近期研究发现，HCC 患者循环                     202 的含量。所用逆转录引物为 5′⁃GTCGTATC⁃
              miR⁃202 与 GPC3 的表达存在负相关关系，但作用                     CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ⁃
              机制不明，需要进一步深入研究以阐明其相互调                             ACAAAGAGG⁃3′；PCR 上游引物5′⁃GCTGGAGAGG⁃
              控关系，为 HCC 的临床早期诊断和治疗提供有效                          TATAGGGCA⁃3′，下游引物 5′⁃GTGCAGGGTCCGAG
              的生物学靶标。                                           GT⁃3′；所用内参 U6 基因上游引物 5′⁃CTCGCTTCG⁃
                                                                GCAGCACATATACT⁃3′，下游引物 5′⁃ACGCTTCAC⁃
              1  材料和方法
                                                                GAATTTGCGTGTC⁃3′。所有引物由上海捷瑞生物工
              1.1  材料                                           程有限公司合成。PCR总反应体系包括上、下游引物
                  收集南京医科大学附属无锡人民医院 2016 年                       各0.8 μL，SYBR@ Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Ref⁃
              1 月—2018 年 12 月手术的原发性 HCC 患者 126 例，               erence Dye Ⅱ0.4 μL，模板 cDNA 2 μL，无菌 ddH2O
              术前未接受化疗、放疗及其他方式治疗，其中男                             补足体积至 20 μL。反应参数为 95 ℃预变性 30 s；
              97 例，女 29 例，男∶女=1∶0.30，年龄 42~81 岁，中位              95 ℃ 3 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。
              年龄 56 岁。所有病例的手术标本均经病理组织学                          1.2.2 肝癌细胞系miR⁃202过表达实验
              检查确诊，其诊断、分型及分期依据美国癌症联合                                 设计miR⁃202 mimics并由广州锐博生物科技公
              委员会（AJCC）与国际抗癌联盟（UICC）的标准。                        司合成。培养HepG2细胞系，按1×10 个/孔接种96孔
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              从临床检验中心获取其中 64 例患者的术前血清冻                          板，24 h后细胞贴壁，换培养液，加入miR⁃202 mimics
              存样本，另取 20 例体检的健康人血清作为对照。                          （终浓度20 nmol/L），继续培养72 h。设置miCtrl阴性
              本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者知情                             对照组。收集细胞，经TRIzol试剂盒裂解细胞提取总
              同意。                                               RNA，采用qRT⁃PCR检测miR⁃202的表达水平。抽提
                  人肝癌 HepG2 细胞系购于中国科学院上海生                       总蛋白，Western blot检测GPC3的表达。

              物细胞研究所，在含有 10％胎牛血清（fetal bovine                   1.2.3 细胞增殖活性的CCK8检测
              serum，FBS）的 DMEM 培养液、37 ℃ 5％CO2的培养                     通过CCK8实验，检测miR⁃202 mimics对HepG2

              箱中培养，待细胞生长至 80%融合度时，加入 0.2%                       细胞增殖活性的影响。5 型野生型病毒（WAd5）作
              胰酶消化，添加含 10%FBS 的 DMEM 培养基进行传                     为对照。收集HepG2细胞，100 μL/孔传至96孔板，
              代培养。                                              每孔1×10 个细胞，24 h后细胞贴壁，换培养液，加入
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