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第41卷第3期 周肖英，林 彬，侯云华，等. miR⁃202及其靶基因Glypican⁃3在肝癌中的表达及其临床意义［J］.
2021年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（03）：349-354 ·351 ·

miR⁃202 mimics，终浓度20 nmol/L，继续培养24、48、 HCC组织 癌旁组织
72 h，每个时间点设8个复孔；弃培养液，加入0.1 mol/L
PBS溶液100 μL/孔，按试剂盒说明加CCK8试剂，置
孵箱内过夜；采用Model 550 Microplate Reader（BIO⁃
RAD公司，美国）测定570 nm波长吸光度值，校正波
长为655 nm，绘制细胞存活曲线。
1.2.4 miR⁃202靶基因的Luciferase报告基因测定 图1 HCC组织及癌旁组织GPC3免疫组化（×200）
Figure 1 Immunohistochemistry of GPC3 in HCC and
合 成 GPC3 基 因 的 3′ ⁃ UTR 野 生 序 列（5′ ⁃
adjacent tissues（×200）
TTATCCTGTATACCTCC ⁃ 3′ ）与 突 变 序 列（5′ ⁃
TTATCCTGCGCGTTATC⁃3′），插入到Luciferase载体
表1 HCC患者GPC3表达与临床病理学特征之间的关系
（pGL3⁃Control，Promega 公司，美国）中，构建 pGL3⁃
Table 1 Relationship between GPC3 expression and clini⁃
GPC3 和 pGL3⁃mGPC3 质粒。收集培养的 HepG2 细
copathological features of HCC
胞，常规铺24孔板，每孔1×10 个细胞。培养24 h后
5
GPC3［n（％）］
换培养液，加入终浓度 20 nmol/L 的 miR⁃202 mimics 临床特征 n P值
阳性 阴性
（设置 miCtrl 为阴性对照），继续培养 24 h。然后取 性别 0.821
pGL3⁃Control 和 pGL3⁃GPC3（或 pGL3⁃mGPC3）各 男 97 75（77.32） 22（22.68）
200 ng，通过 Effectene Transfection Reagent（Qiagen 女 29 23（79.31） 6（20.69）
公司，美国）分别与pRL⁃TK 20 ng共转染，再继续培 年龄 a 0.446
≥ 56岁 64 48（75.00） 16（25.00）
养 48 h。参考 Dual⁃Luciferase Reporter Assay System
试剂盒说明，进行细胞的裂解回收，以 LB⁃9506 型 < 56岁 62 50（80.65） 12（19.35）
组织学类型 0.029
Luminometer（Berthold Technologies 公司，美国）测定
分化型 62 42（67.74） 20（32.26）
Luciferase活性，实验重复3次。
低分化型 41 36（87.80） 5（12.20）
1.3 统计学方法
未分化型 23 20（86.96） 3（13.04）
采用统计学软件 SPSS 18.0 进行数据分析。计 肿瘤大小 b 0.244
量资料以均值±标准差（x ± s）描述，多组间比较采用 ≥ 5.0 cm 75 61（81.33） 14（18.67）
单因素方差分析，两两比较采用q检验；计数资料采 < 5.0 cm 51 37（72.55） 14（27.45）
用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 微血管侵犯 <0.001
阳性 82 77（93.90） 5（6.10）0
2 结 果 阴性 44 21（47.73） 23（52.27）
BCLC临床分期 0.423
2.1 HCC患者肝组织GPC3表达与临床病理学特征
Stage A 29 20（68.97） 9（31.03）
之间的关系
Stage B 63 51（80.95） 12（19.05）
HCC 患者 126 例中，GPC3 总阳性率为 77.78%
Stage C~D 34 27（79.41） 7（20.59）
（98/126），阳性物质分布于胞核和胞浆（图 1），而癌
a：56岁为所有患者的中位年龄；b：最大径和最小径的平均值为
旁组织阳性率仅为 8.73%（11/126），癌组织 GPC 表 5.0 cm。
2
达 水 平 明 显 高 于 癌 旁 组 织（χ =122.370，P <
0.001）。分析 GPC3 与 HCC 临床病理学特征的关 发现，HCC 患者血清 miR⁃202 含量明显低于健康人
系，结果显示，GPC3表达水平与HCC细胞组织学分 （图 2A）。进一步分析血清 miR⁃202 含量与癌组织
化类型有关，低分化类型HCC的GPC3阳性率较高； GPC3的关系，发现GPC3阳性患者具有更低的循环
GPC3水平与HCC肝内微血管侵犯相关，但与性别、 miR⁃202水平（图2B）。
年龄、肿瘤大小、临床分期无关（表1）。 2.3 肝癌细胞过表达miR⁃202能下调GPC3含量

2.2 肝癌患者循环miR⁃202水平及其与GPC3之间 HepG2 细胞转染 miR⁃202 mimics 后，qRT⁃PCR
的关系 检测miR⁃202表达发现，细胞miR⁃202水平升高（图
64例HCC患者术前血清样本及20例健康人对 3A）。Western blot 检测 GPC3 的表达，发现随 miR⁃
照血清样本，经qRT⁃PCR检测miR⁃202的含量，结果 202水平升高，癌细胞GPC3水平下降（图3B、C）。