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第40卷第6期41卷第3期
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                                                                                                   2021
               ·356 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2020年6月年3月

              immune cells. The three kinds of cytotoxic function assay are consistent. Double living cell dye labeling assay is suitable for detecting
              the killing of suspended target cells，and luciferase assay is more suitable than LDH release method for the killing of adherent cells.
             ［Key words］ immune cells；proliferation；cytotoxic function；detection methods；comparative study
                                                                         ［J Nanjing Med Univ，2021，41（03）：355⁃360，414］





                  免疫治疗已经成为肿瘤综合治疗的主要手段                   ［1-2］ 。
                                                                1  材料和方法
              免疫治疗的手段之一，基于 T 细胞、NK 细胞的过继
              性细胞免疫治疗在血液肿瘤、黑色素瘤等已取得                             1.1  材料
              显著进展    ［3-4］ ，在实体瘤方面，嵌合抗原受体 T 细胞                      NK92 细胞系、带有荧光素酶的 K562 细胞系由

              免疫疗法（chimeric antigen receptor T⁃cell immuno⁃     合作单位天津天锐生物科技有限公司赠送；白细胞
              therapy）的临床应用研究也正在积极开展。过继                         介素（interleukin，IL）⁃2（长春生物制品研究所）；IL⁃
              性细胞免疫治疗的发展离不开 T、NK 等免疫细胞                          15（Proteintech 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒、钙黄绿
              放大培养和杀伤功能的实验技术与基础研究的                              素 Calcein⁃AM（同仁化学公司，日本）；EdU 试剂盒
              发展。开展过继性细胞免疫治疗的基础研究、临                             （苏州 US EVERBRIGHT 公司）；CFSE（Sigma 公司，
              床应用研究和转化研究的首要前提是建立稳定、                             美国）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细
              相对精准、适合免疫细胞特点的检测方法与技术                             胞毒性检测试剂盒（上海碧云天公司）；CellTracker
              平台。                                               Deep Red（Invitrogen 公司，美国）；ATP（北京阿拉丁
                  免疫效应细胞增殖与细胞毒性功能的精准检                           公司）；Triton X⁃100（北京索莱宝公司）；荧光素钠
              测是实际工作的关键。一方面，经验显示1 cm 大小                         （BioVision公司，美国）。
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              的瘤块中约有1×10 个瘤细胞，需要至少10倍于瘤细                        1.2  方法
                               10
                                                       ［5］
              胞的免疫细胞才能保证有效的抑制和杀伤效果 ，因                           1.2.1 细胞培养与实验分组
              此在免疫效应细胞长期稳定扩增培养的技术平台                                  NK92 细胞的培养方法参照 ATCC 的标准培养
              上，增殖实验不可或缺。另一方面，对于体外分离、                           （https：//www.atcc.org/products/all/CRL⁃2407.aspx#cul
              扩增或改造的免疫效应细胞的体内应用，需要通过                            turemethod），按照培养条件不同分为2 个实验组：组
              大量的体外细胞毒实验，准确鉴定效应细胞杀伤肿                            1 加 100 U/mL IL⁃2，组 2 加 100 U/mL IL⁃2+10 U/mL
              瘤靶细胞的功能。现有的体外增殖和细胞毒相关                             IL⁃15 。K562 培养于含 10%胎牛血清的 RPMI⁃
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              的实验方法种类繁多，准确性、经济性、可操作性不                           1640 和 DMEM 中。所有细胞均在 37 ℃、5% CO2培
              一，而且部分实验受限于实验室条件无法开展。选                            养箱培养。
              对适合的增殖或细胞毒实验方法，不仅可以少走弯                            1.2.2 CCK⁃8法检测细胞增殖
              路、事半功倍、节省有限的经费和实验资源，而且有                                按照试剂盒说明书，将处于对数生长期的
              助于建立稳定精准的技术平台和进一步推进过继                             NK92 细胞以1×10 个/孔接种于96孔板中，每个检测
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              性免疫治疗相关的研究。因此，鉴定免疫效应细胞                            时间点设置5个复孔，每孔100 μL培养体系。96孔板
              增殖能力和细胞毒活性技术方法的对比研究与系                             四周加入 PBS 以防止板中的细胞培养液蒸发。在
              统总结有重要的实用价值。                                      37 ℃、5% CO2培养箱培养不同时间后，每孔分别加入
                  NK92 细胞系由Klingemann 博士的实验室分离                  10 μL CCK⁃8试剂，以100 μL细胞悬液+10 μL CCK⁃8
              和鉴定，来自患有 NK 细胞淋巴瘤的患者 。相对                          体系进行孵育。预实验确定最佳孵育时间，即在培
                                                    ［6］
              于从志愿者体内原代分离的免疫效应细胞，NK92                           养箱中孵育1.5 h后使用酶标仪在450 nm波长处测定
              细胞系具有免疫效应细胞的悬浮培养特性、增殖特                            吸光度值，D（450 nm） 实验组-D（450 nm） 空白对照的值间接
              性和杀伤能力，是可替代原代效应细胞的稳定实验                            反映活细胞的数量。空白对照指仅有培养液而未
              模型。因此，本研究以NK92为实验模型细胞，对比                          加细胞的孔。
              研究与系统总结目前常用的体外增殖和细胞毒相                             1.2.3 EdU标记法检测细胞增殖
              关的实验方法，旨在总结各类方法的特点与适用性                                 用培养基调整NK92细胞密度为1×10 个/mL进
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              的实践经验。                                            行EdU标记，预实验确定加入EdU的浓度为50 μmol/L，
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