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第41卷第3期 徐大来，司 远，田 蕾，等. 免疫效应细胞增殖与细胞毒性功能检测3种方法的比较［J］.
2021年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（03）：355-360，414 ·357 ·

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培养箱孵育 2 h。经 4%多聚甲醛固定 15 min 和 释放孔D（490 nm）］× 100% 。
0.5% Triton X⁃100 通透 5 min 处理后，每 1×10 个细 1.2.7 荧光素酶法检测细胞毒功能
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胞加入500 μL现配的Click⁃iT反应混合物避光染色 将 K562 细胞的密度调整为 1×10 个/mL。然后
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30 min 后加入 DAPI 室温避光 15 min 进行核染色。 铺 96 孔板，每孔加靶细胞悬液 100 μL，按照不同效
使用流式细胞仪或者荧光显微镜检测与分析 EdU 靶比分别加入效应细胞，空白对照不加效应细胞，
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阳性的细胞占比 。 并定容至 200 μL。放置培养箱 4 h 后。按照每孔
1.2.4 CFSE标记法流式检测细胞增殖 50 μL 用量，将 2 mg/mL ATP 溶液与 300 ng/mL 荧光
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将NK92细胞用PBS洗涤1遍并重悬。2×10 个/mL 素钠溶液按照1∶3配制发光底物混合液。取出孵育
的 NK92 细胞悬液加入 1 μL 5 mmol/L 的 CFSE 储存 过后的96孔板，每孔加入50 μL 2% Triton X⁃100，吹
液，配制 5 μmol/L 的工作液。37 ℃避光孵育 10 min 打混匀室温静置 5 min，再次吹打混匀后每孔吸出
后，加入 4 ℃预冷的 5 倍体积含血清的细胞培养液 50 μL 转移到黑色 96 孔酶标板，并加入 50 μL 发光
终止染色，5 min后离心（300 g 5 min），并用PBS洗2遍 底物混合液，吹打混匀后 5 min 内用活体成像仪或
后，加入培养基继续培养。分别于 CFSE 标记后的 FLUOstar Omega 多功能读板机检测荧光值。效应
不同时间点用流式细胞仪检测NK92的平均荧光强 细胞毒性=（空白组荧光值-实验组荧光值）/空白组
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度，扩增后与扩增前的平均荧光强度比值反映细胞 荧光值×100% 。
的扩增倍数 ［7-8］ 。 1.3 统计学方法

1.2.5 Calcein⁃AM/CellTracker Deep Red 活细胞染 所有数据采用 SPSS20.0 统计软件及 GraphPad
料双标流式法检测细胞毒功能 Prism 5进行分析。统计结果以均数±标准差（x ± s）
用培养基将靶细胞 K562 调整为 1×10 个/mL， 表示，均数间比较用两独立样本 t 检验。等级相关
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分别加入Calcein⁃AM 至终浓度2 μmol/L、CellTracker 采用 Spearman 秩相关系数评价荧光素酶法、LDH释
Deep Red Dye 至终浓度 0.1 μmol/L，37 ℃避光孵育 放法与活细胞染料双标流式法的关联。以P＜0.05
30 min后，PBS清洗2遍后用培养基将细胞密度调整为 为差异有统计学意义。
2×10 个/mL，加入96孔U型底板，每孔加入100 μL；
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2 结 果
按照不同效靶比加入效应细胞，并定容至 200 μL。
将培养板置于 1 000 r/min 离心 1 min，放入 37 ℃ 2.1 CCK⁃8 法、EdU 标记法与 CFSE 标记法检测两
培养箱静置 4 h 进行杀伤后，吹匀细胞，用流式细 组NK92细胞增殖能力
胞仪上样，注意进样相同体积数的分组样品。双 CCK⁃8法连续4 d检测两组细胞增殖提示，组2
阳性细胞群为剩余活的靶细胞。设置阳性对照： 的NK92增殖能力强于组1，但差异并无统计学意义
标记过的靶细胞不加效应细胞。效应细胞毒性 （P＞0.05，图 1A）；而 EdU 标记法与 CFSE 标记法提
（%）=（空白对照读数-实验组读数）/空白对照读 示，与组 1 相比，组 2 的 NK92 增殖能力更强且差异
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数×100% 。 显著（P＜0.05，图1B~E）。可以看出，对于悬浮免疫
1.2.6 LDH释放法检测细胞毒功能 细胞，CCK⁃8法缺乏一定的灵敏度，并未检测出两组
根据效靶比准备实验需要的细胞数。将靶细 细胞间的增殖差异；而 EdU 和 CFSE 标记法则相对
胞的密度调整为1×10 个/mL，取100 μL加入U型96孔 灵敏。
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培养板中，根据不同效靶比加入效应细胞，定容至 2.2 3 种细胞毒性检测方法检测两组 NK92 细胞对
200 μL；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 K562的细胞毒性

100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和 2.5%Triton 以 K562 为靶细胞，组 1 和组 2 的 NK92 细胞为
X⁃100各100 μL，放入培养箱中4 h。然后将96孔培 效应细胞，分别在效靶比为2.5∶1、5∶1和10∶1下，进
养板以250 g离心5 min，每孔吸取上清100 μL置于 行4 h的共孵育。活细胞染料双标流式法能够有效
平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，反 检测出组1和组2效应细胞在不同效靶比下的细胞
应 5 min，每孔加入 30 μL HCl（1 mol/L），在酶标仪 毒性差异（P＜0.05，图 2A 和 B）。同样，荧光素酶法
490 nm 处测定吸光度值。按下式计算效应细胞毒 也能检测出组1和组2效应细胞在不同效靶比下的
活性。效应细胞毒性（%）=［反应孔 D（490 nm）-自 细胞毒性差异（P＜0.05，图 2C、D）。图 2E 显示 3 次
然释放孔 D（490 nm）/最大释放孔 D（490 nm）-自然 LDH 释放实验检测两组效应细胞的细胞毒性统计