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第40卷第6期41卷第3期
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               ·362 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2020年6月年3月
                                                                                                   2021

                  人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）位          HPA 基因分型参考质粒建立人 HPA1⁃29W 系统基
              于血小板膜糖蛋白上，由GenBank数据库中ITGA2B、                     因分型的质谱检测方法，并以50例已知HPA分型的
              ITGB3、GP1BA、ITGA2、GP1BB 和 CD109 相关序列              献血者样本对该方法进行验证和确认。
              进行编码。在临床血小板输注过程中，输注HPA不                                基因组DNA制备：采用磁珠法提取试剂盒在全
              匹配的血小板，可导致受血者机体产生血小板同种                            自动核酸提取仪上进行基因组DNA提取，DNA终浓
              抗体，引起同种免疫血小板减少综合征、输血后紫                            度为10~200 ng/μL。
              癜、血小板输注无效等输血不良反应                ［1-4］ 。尽管血清            多重 PCR 扩增：使用美国 Sequenom 公司 Geno⁃
              学交叉配合试验可以降低输血不良反应的发生率，                            typing Tools MassARRAY Assay Design 软件 针对所
                                                                                                      ［6］
              但无法预防需长期输注血小板患者同种抗体的产                             有靶点 SNP 或突变（表 1），设计 PCR 扩增引物及单
              生，因此通过对献血者和患者进行血小板基因分                             碱基延伸引物（由上海生工公司合成，表 2）。将待
              型，为患者提供 HPA 基因型相匹配的血小板，可以                         测的所有样品信息进行排版，每份样品做2个复孔，
              有效避免血小板特异性免疫反应的发生，提高输血                            使用多重PCR技术在384孔板上扩增含有目的SNP
              的疗效和安全性，因此建立基于基因配型的血小板                            的DNA 序列，PCR 扩增体系为5 μL，包括2 μL待测
              捐献者血型资料库是解决需长期输注血小板患者                             DNA 样本（浓度 20~50 ng/μL）和 3 μL 反应体系（含
              同种免疫反应的有效途径，在临床输血应用中具有                            1 μL 0.5 μmol/L PCR 引物工作液，0.8 μL RNase⁃
              重要意义。本研究的目的就是建立国内首个基于                             free Water，0.5 μL 10×Buffer，0.4 μL 25 mmol/L MgCl2，
              MassARRAY 平台的人 HPA1~29W 系统基因分型的                   0.1 μL 25 mmol/L dNTP，0.2 μL 5 U/μL Hotstar⁃
              质谱检测方法，为血小板的建库工作提供高效和高                            Taq）。PCR 扩增条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s 、
              性价比的HPA基因分型方法。                                    56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，45个循环；72 ℃ 5 min；12 ℃
                                                                保持。
              1  材料和方法
                                                                     碱性磷酸酶处理：扩增成功的PCR产物每孔取
              1.1  材料                                           5 μL 加入核酸外切酶Ⅰ2.5 U，碱性磷酸酶 0.5 U 进
                  12 个插入 HPA1⁃29W 野生型和突变型序列的                    行纯化，去除未结合的 dNTP，纯化反应的条件为：
              合成质粒以及 50 例经 PCR⁃SSP 检测的已知 HPA 分                  37 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min；12 ℃保持。
              型的献血者样本。本研究经江苏省血液中心伦理                                   iPLEX单碱基延伸：针对每个靶点SNP设计1条
              委员会批准，所有受试者知情同意。                                  延伸引物，将混合好的延伸引物加入上述纯化后的
                  采用全自动核酸提取仪（E.HT01.Z0.0096）及配                  产物中，以 ddNTP 为底物，进行单碱基延伸，每个
              套的全血 DNA 提取试剂盒（K.QX02.B0.1000）（南京                 SNP 的等位基因延伸产物仅有末端 1 个碱基的差
              中 科 拜 尔 公 司），384 孔 板 PCR 扩 增 仪（Ge⁃                异，单碱基延伸程序如下：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，
              nAmp9700，ABI公司，美国），SDx MassARRAY MAL⁃             （52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s，5 个循环），40 个循环；72 ℃
              DI⁃TOF质谱检测系统、Complete iPLEX Pro Genotyp⁃          3 min；12 ℃保持。
              ing Reagent Set（Agena公司，美国），RNase⁃free Water           核酸质谱检测：利用Nano树脂板（规格为6 mg）
             （货号为RT121⁃02，北京天根公司）等。                             纯化单碱基延伸的产物，并将产物转移到 Spectro⁃
              1.2  方法                                           CHIP芯片上，进行质谱检测，将样品结果进行聚类，
              1.2.1  HPA1⁃29W野生型和突变型序列参考质粒的                     根据聚类图进行结果判读，判读完成后导出 Plate⁃
              构建                                                Data数据。同1个SNP的等位基因由于碱基不同导
                  针对HPA1⁃29W野生型（A型）和突变型（B型）所                    致分子量不同，形成不同的检测峰而被区分。

              有靶点单核苷酸多态性（single nucleotide polymor⁃                  灵敏度分析：利用检测质粒样品，29 个等位基
              phism，SNP）或突变位点 （表1）及其两端100个左右                    因共 58 个位点，每种分型检测 1 次，计算灵敏度。
                                   ［5］
              碱基序列设计插入片段序列，合成后克隆至pUC57载                         灵敏度=真阳性结果/（真阳性结果+假阴性结果）×
              体，转化E. coli DH5，提取质粒、酶切鉴定并测序。                     100%。真阳性结果是质粒结果为非A型、质谱结果

              1.2.2  基于 MassARRAY 平台的人 HPA1⁃29W 系统              也为非A型的数量。假阴性结果是质粒结果为非A
              基因分型的质谱检测方法的建立                                    型、质谱结果为A型的数量。灵敏度100%为达标。
                  以包含 HPA⁃1a~29a 和 HPA⁃1b~29bw 序列的                   特异度分析：检测质粒样品，58 个位点每种分
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