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第41卷第5期                  傅 恒，王丽娜，杨月美，等. ADAM15在支气管哮喘表达及意义［J］.
                  2021年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（05）：684-689                       ·685 ·


                ciation studies，GWAS）发现，过敏性哮喘的发生与整                20 μL。
                合素样金属蛋白酶 15（a disintegrin and metallopro⁃         1.2.3  酶联免疫吸附实验（enzyme linked immuno⁃
                                               ［3］
                teinase 15，ADAM15）基因密切相关 ，高度提示AD⁃                 sorbent assay，ELISA）
                AM15 在哮喘疾病中起重要作用，但其机制尚不清                              采 用 人 ADAM15 ELISA 检 测 试 剂 盒（SEKH ⁃
                楚。目前发现ADAM15可使B 细胞释放促进IgE 合                       0078，北京索莱宝科技有限公司）说明书进行，将待
                成的可溶性 CD23（sCD23），是一种潜在的内源性                       测血清和试剂室温平衡30 min，洗板3次并甩干，加
                IgE 调节剂 。基于 IgE 在哮喘中的关键作用，本文                      样（标准品及样本）100 μL至ELISA板内，37 ℃烘箱
                         ［4］
                推测，ADAM15可能通过促进IgE合成，参与疾病的                        孵育90 min，洗板4次，洗板后加100 μL生物素化抗
                发生发展。                                             体工作液，37 ℃烘箱孵育1 h，洗板4次，再加100 μL
                    本研究拟在人体、动物和细胞水平研究哮喘过                          酶结合工作液，于 37 ℃烘箱孵育 30 min，洗板 5 次，
                程中 ADAM15 表达及分布，并探讨其与 IgE 的相关                     加入显色底物 100 μL，37 ℃烘箱避光孵育 15 min，
                性及可能调控机制，了解其在哮喘形成中的作用。                            待标准孔蓝色深度合适时，加50 μL终止液，放置于
                                                                  酶标仪中450 nm波长检测每孔光密度值。
                1  对象和方法
                                                                  1.2.4 免疫组化
                1.1  对象                                               最后一次OVA激发后24 h处理小鼠，取每只小
                    纳入2018年6月—2020年4月就诊于南京医科                      鼠右下肺最大横径处肺组织，采用石蜡切片机进行
                大学第一附属医院呼吸内科门诊的支气管哮喘患                             连续切片。石蜡切片置于烘箱脱蜡 60 ℃烘 2 h，依
                者 32 例，所有病例均依据 2018 年全球哮喘防治倡                      次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ浸泡切片 15 min，后梯度浸泡
                议（Global Initiative For Asthma，GINA）的诊断标准         于100%、95%、90%、80%、60%的乙醇各3 min，最后
                进行诊断。同期收集 16 例健康志愿者作为正常对                          用PBS浸洗2次，每次3 min。置于含柠檬酸缓冲液
                照组，受试者均签署知情同意书，并通过南京医科                            的高压锅中，沸水修复2 min，冷却至室温后，用PBS
                大学第一附属医院医学伦理委员会许可。两组人                             冲洗2次，每次5 min。室温将切片置于3%H2O2溶液
                群均无吸烟者，通过卡方检验或独立样本 t 检验分                          15 min 以灭活内源性酶，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。
                析发现，性别、年龄无明显差异：①性别（男/女），对                         吸去组织周围液体，油笔画圈，10%山羊血清室温封
                照（3/13）vs. 哮喘（8/24）（P=0.627）；②年龄（岁），对             闭1 h，PBST冲洗3次，每次5 min。滴加ADAM15抗
                照（48.19±1.89）vs. 哮喘（42.44±2.82）（P=0.180）。         体（K008285P，北京索莱宝科技有限公司），4 ℃湿盒
                    SPF级雌性6~8周BALB/c小鼠10只（北京维通                    过夜。第 2 天，甩去一抗稀释液，PBST 冲洗 3 次，每
                利华实验动物技术有限公司），饲养于南京医科大                            次5 min。每个圈内组织滴加100 μL生物素标记的
                学动物实验基地。动物实验均按规范严格进行。                             二抗（1∶500 稀释）室温孵育 1 h，PBST 冲洗 3 次，每
                1.2  方法                                           次 5 min。每个圈内组织滴加预制好的显色剂 DAB
                1.2.1 临床资料和血清标本收集                                 工作液50 μL，在显微镜下观察显色情况，染色好后
                    入组时收集受试者临床信息（包括一般情况、                          用蒸馏水洗涤。苏木素30 s染核，立即蒸馏水洗涤，
                病史和既往史等），用含分离胶/促凝剂的真空采血                           1%盐酸酒精分化，温水反蓝。梯度 60%、80%、
                管分别采集晨起空腹外周静脉血 5 mL，对其外周                          90%、95%、100%的乙醇脱水，每次3 min；二甲苯Ⅱ、
                血行细胞分类计数。余外周血室温静置 20 min，                         Ⅰ依次浸泡3 min。最后采用中性树脂封片，盖玻片
                以 3 000 r/min、4 ℃离心10 min，获得上层血清，检测               固定后在显微镜下观察。
                受试者血清ADAM15和总IgE水平。                               1.2.5 人支气管上皮细胞（16HBE）培养
                1.2.2 哮喘小鼠模型构建                                        用含10%胎牛血清（Gibco公司，美国）、1%双抗
                    随机将动物分为两组：对照组（n=5）和哮喘组                        的 RPMI1640（Gibco 公司，美国）培养基培养人支气
               （n=5），分别于第0、7、14天致敏哮喘组小鼠，腹腔内                       管上皮细胞株 16 HBE（北京肿瘤研究所），放入
                注射鸡卵清蛋白（OVA）+氢氧化铝的混悬液4 mL/kg，                     37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育。隔日换液、待细
                对照组小鼠腹腔内注射生理盐水4 mL/kg；分别于第                        胞长至90%时胰酶消化、传代，布板至6孔板和12孔

                20、21、22 天激发哮喘组小鼠，采用浓度为 4 mg/mL                   板，待细胞长至密度80%时用无血清的1640培养基
                的 OVA 溶液滴鼻 20 μL，对照组小鼠生理盐水滴鼻                      饥饿6~12 h。
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