Page 56 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 56

第41卷第5期
               ·686 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年5月


              1.2.6 实时定量PCR                                     ELISA检测，结果表明，与健康对照者相比，哮喘患者
                  待细胞布板至 12 孔板并饥饿 6⁃8 h 后，用人源                   血清中的ADAM15水平增高［（749.5±132.3）pg/mL vs.
              性重组细胞因子 IL⁃4（BK0245，Bioworld 公司，美                 （398.90 ± 22.13）pg/mL］，差 异 有 统 计 学 意 义（P=
              国）、IL⁃13（213⁃ILB/CF，R&D 公司，美国）、IL⁃17              0.023，图1）。
             （BK0234，Bioworld 公司，美国）、TNF⁃α（PR1125，
                                                                          1 000         P=0.023
              Bioworld公司，美国）分别刺激16HBE 12、24 h，以不
              加干预措施的细胞为对照组。移去细胞培养基，用                                       800
              预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞后，每孔加入                                   （ pg/mL）  600
              1 mL TRIzol（TaKaRa 公司，日本）以提取细胞总
              RNA，逆转录后加入 SYBR Green 后进行RT⁃PCR 实                          ADAM15  400

              验。扩增条件为：预变性95 ℃ 30 s→变性 95 ℃ 5 s→                            200
              退火 60 ℃ 30 s→延伸 72 ℃ 10 min，共 40 个循环。
                                                                             0
                                      -△△C T
              以 GAPDH 为内参，计算 2            值，最后比较目的基                                对照组       哮喘组
                                                                    图1 哮喘患者与健康对照组血清ADAM15的表达
              因在细胞中的相对表达量。所用引物委托南京Re⁃
                                                                Figure 1  Serum ADAM15 expression in asthmatic pa⁃
              algene 公 司 合 成 ：人 GAPDH 上 游 引 物 5′ ⁃
                                                                          tients and healthy controls
              AGAAGGCTGGGGCT ⁃ CATTTG ⁃ 3′ ；下 游 引 物 5′ ⁃
              AGGGGCCATCCACAGTC⁃TTC⁃3′；人 ADAM15 上游              2.2  血清 ADAM15 表达水平与外周血嗜酸性粒细
              引物 5′⁃CAGGACGATCTCCCAATTAGC⁃3′；下游引                胞数、血清总IgE水平的相关性分析
              物5′⁃GGACCAACTCCCTATTCTGTAGC⁃3′。                        分别以哮喘患者外周血嗜酸性粒细胞计数与

              1.2.7 Western blot                                百分比、血清总IgE水平为纵坐标，血清ADAM15水
                  细胞布板至6孔板并饥饿6~8 h，以人源重组细                       平为横坐标，对所有样本进行相关性分析发现，血
              胞因子 IL⁃13（10 ng/mL）（213⁃ILB/CF，R&D 公司，美           清 ADAM15 水平与嗜酸性粒细胞计数及百分比无
              国）刺激 16HBE 24 h，经 PBS 洗 3 次，用蛋白裂解液                明显相关，而与总IgE水平呈显著正相关（r=0.542 5，
              提取总蛋白，并用BCA法测得蛋白含量。蛋白提取                           P=0.001 6），相关性有统计学意义（图2）。
              完成后制备SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶，采用80/120 V 恒                     2.3  ADAM15在哮喘小鼠肺组织中的表达
              压电泳，300 mA 恒流转移至PVDF 膜上，5% BSA洗                        小鼠肺组织免疫组化表明，ADAM15 在肺组织
              涤缓冲液室温封闭 2 h，加入 β⁃actin 抗体（T0022，                 中主要表达于支气管上皮细胞，且哮喘小鼠支气管上
              Affinity 公司，美国）及 ADAM15 抗体（K008285P，北             皮细胞ADAM15表达水平较对照小鼠升高（图3）。
              京索莱宝科技有限公司）4 ℃冰箱孵育过夜，第 2 天                        2.4  IL⁃13上调16HBE中ADAM15的转录水平
                                                                     分别用10 ng/mL 的IL⁃4、IL⁃13、IL⁃17、TNF⁃α处
              采用 TBST 洗涤缓冲液洗涤后，用鼠抗兔二抗（sc⁃
              2357，Santa Cruz 公司，美国）室温1 h。使用Molecu⁃             理 16HBE 细胞 12 h 和 24 h，PCR 结果表明，与不加
              lar Imager ChemiDoc XRS+数字成像系统，用电化学               任何细胞因子干预的对照组相比，其中 IL⁃13 干预
                                TM
              曝光液成像，以β⁃actin 为内参，比较 ADAM15 的相                   24 h 可显著上调 16HBE 内 ADAM15 mRNA 的表达
              对表达量。                                             水平（P < 0.01，图4）。
              1.3  统计学方法                                        2.5  IL⁃13上调16HBE中ADAM15的蛋白水平
                  应用 GraphPad Prism 8 进行统计学分析，所有                     用 10 ng/mL 的重组 IL⁃13 细胞因子处理 16HBE
              定量资料以均数±标准误（x ± sx ）表示，两组资料间                      细胞 24 h，Western blot 结果表明，与不加干预的对
              的比较采用独立样本 t 检验，多组资料之间的比较                          照组相比，16HBE细胞内ADAM15的蛋白表达增加
              采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson直线                        （P < 0.05，图5）。
              相关分析法。P < 0.05 为差异有统计学意义。
                                                                3  讨 论
              2  结 果
                                                                     本研究首次就 ADAM15 在支气管哮喘中可能
              2.1  哮喘患者血清中ADAM15表达升高                            作用进行研究，发现ADAM15在哮喘患者血清中表
                  对32例哮喘患者和16例健康对照者血清进行                         达升高，与血清总IgE水平成正相关；哮喘小鼠模型
   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61