Page 20 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第6期
               ·798 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年6月


              1.2  方法                                           一抗4 ℃摇床过夜。第2天吸弃一抗，全程避光，荧
              1.2.1 细胞分离与培养                                     光二抗室温孵育1 h，吸弃二抗，DAPI染核6 min，封
                  CF 和心肌细胞（myocardial cell，MC）从南京医              片，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。
              科大学实验动物中心提供的出生 1~3 d 的 SPF 级                      1.3  统计学方法
              ICR 乳小鼠的心脏中分离，本研究经南京医科大学                               每组数据均来自 3 次独立的实验，所有统计分
              实验动物福利伦理委员会批准。分离出的细胞在                             析均使用SPSS25.0进行。正态分布数据采用均数±
              含有 10%胎牛血清和 1%双抗的 DMEM 高糖培养基                      标准差（x ± s）表示，两组间比较采用双尾未配对t检
              中培养，培养箱温度为 37 ℃、CO2 为 5%。使用                       验，多重比较采用单因素方差分析和Tukey检验，所
              0.25%的胰酶进行消化传代，细胞传至第3代后随机                         有结果均使用GraphPad Prism 8.0表示。P＜0.05为
              分组，用于实验。                                          差异有统计学意义。
              1.2.2 LMW⁃HA刺激
                                                                2  结 果
                  将 LMW⁃HA 溶于 10% FBS 的 DMEM 高糖培养
              基中混匀，CF 用无血清的培养基饥饿过夜后，换成                          2.1  CD44与S100A4在CF中高表达
              含有LMW⁃HA的培养基。                                          首 先 检 测 ICR 乳 小 鼠 CF 和 MC 中 CD44 和
              1.2.3 CD44抑制剂处理                                   S100A4 mRNA 和蛋白的表达。 qRT⁃PCR 对 CD44
                  将CD44抑制剂BRIC⁃235提前24 h加入培养皿                   和 S100A4 mRNA 进行定量分析（图 1A、B），Western
              中，37 ℃、5%CO2孵育 24 h 后换成含有 LMW⁃HA 的                blot 对两者的蛋白进行定量分析（图 1C~E）。结果
              培养基。                                              表明，CF 中 CD44 和 S100A4 的表达量均显著高于
              1.2.4 CCK⁃8细胞增殖实验                                 MC（P＜0.01）。
                  用胰酶将 CF 消化后进行细胞计数，在 96 孔板                     2.2  LMW⁃HA刺激的最佳浓度
              中按照每孔100 μL 3 000个细胞的密度加入细胞悬                           CCK⁃8细胞增殖实验显示（图2A），分别用不同
              液，CF贴壁后加入 LMW⁃HA 刺激，一定时间后换成                       浓度的 LMW⁃HA 刺激 CF，当浓度≥0.2 mg/mL 时 CF
              普通培养基继续孵育。向每孔加入 10 μL CCK⁃8                       的增殖与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），
              试剂，继续孵育 1 h 后用酶标仪测定 450 nm 处吸光                    0.8 mg/mL LMW⁃HA 作用下，CF 的增殖最明显。
              度。                                                EdU 染色法同样证明了0.2 mg/mL 的LMW⁃HA 已经
              1.2.5 Western blot检测                              开始对CF的增殖产生影响（图2B）。因此，后续实验
                  针对细胞总蛋白，收取细胞并且冰上裂解，孵                          采用0.8 mg/mL的LMW⁃HA对CF进行刺激并培养。
              育 15 min，刮下蛋白后 4 ℃ 12 000 g 离心 20 min，收           2.3  LMW⁃HA刺激后CF的表型转化
              集上清液；使用试剂盒分别提取细胞浆蛋白与核蛋                                 PCR 和 Western blot 显示，CF 中的心肌纤维化
              白。应用 BCA 法测定蛋白浓度，等量蛋白经 SDS⁃                       标志物α⁃SMA和Collagen 3的表达在LMW⁃HA刺激
              PAGE电泳后转移到PVDF膜上。室温下5%BSA封                        8 h 时开始增加，刺激 12 h 时显著增加（P＜0.01）；
              闭1 h后，一抗4 ℃摇床孵育过夜。第2天二抗孵育                         CD44 mRNA 和 蛋 白 的 表 达 不 随 时 间 变 化（P＞
              2 h，使用 ECL 高敏化学发光试剂检测目的蛋白的                        0.05）；LMW⁃HA刺激8 h后S100A4 mRNA和蛋白表
              表达。                                               达时开始缓慢增加（P＜0.05），刺激12 h后显著增加
              1.2.6 实时定量PCR（qRT⁃PCR）检测                          （P＜0.01，图3A、B）。采用α⁃SMA和S100A4细胞免
                  收取细胞并用 TRIzol 法提取 mRNA，用试剂盒                   疫荧光染色观察到，CF 在 LMW⁃HA 的作用下向肌
              对总 mRNA 进行逆转录（37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s）合              成纤维细胞分化（图3C）。
              成 cDNA。用 SYBRGreen 法进行 qRT⁃PCR 检测，                2.4  LMW⁃HA 刺激使 CD44 与 S100A4 蛋白从胞浆
              95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40个循环，最           进入胞核
              后退火。采用StepOne Plus实时PCR系统进行分析。                         为了研究CD44与S100A4蛋白是否从胞浆进入
              1.2.7 免疫荧光检测                                      胞核，对细胞浆蛋白与核蛋白进行分离，然后通过
                  CF 传代至共聚焦培养皿中，37 ℃ 5%CO2孵育                    Western blot 证明，LMW⁃HA 刺激仅 15 min 后，胞浆
              过夜。第 2 天用 4%多聚甲醛固定 30 min，0.3%                    中的 CD44 蛋白表达量即开始降低（图 4A），同时胞
              Triton X⁃100破膜15 min，5%NGS室温封闭1 h，加入              核中的 CD44 蛋白逐渐增加（P＜0.05，图 4B），而
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