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第41卷第6期      马文杰，洪     牮，朱梦琳，等. 低分子量透明质酸通过CD44调控S100A4核转移促进心肌纤维化［J］.
                  2021年6月                   南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：796-803，825                     ·797 ·


                    随着经济的发展、生活水平的提高及老龄化社                              S100A4蛋白是S100家族的一员，又称成纤维
                会的到来，心血管疾病的发病率日益上升，心肌纤                            细胞特异性蛋白1，是器官纤维化的分子标志物，主
                维化是心血管疾病的一个重要病理特征，最终可引                            要参与细胞的分化和增殖             ［18］ 。在肿瘤、肺、肾脏、
                起心功能不全等一系列严重病理损害，甚至导致死                            肝脏及心脏纤维化组织中明显表达，但具体机制
                亡 。                                               不明  ［19-20］ 。本课题组前期研究显示，缺氧刺激乳大
                 ［1］
                    细胞外基质沉积是心肌纤维化的主要病理特                           鼠成纤维细胞及心梗小鼠模型中发现α⁃SMA、
                征，以往心肌纤维化的研究热点是胶原蛋白，然而                            S100A4、β⁃catenin、Collegen 1和Collegen 3表达水平
                除胶原蛋白外，透明质酸（hyaluronic acid，HA）也被                 明显增高。而在心梗组小鼠心肌注射病毒转染
                认为是细胞外基质的重要成分。HA是一种自然形                            S100A4 敲低基因后，Masson 染色提示胶原成分减
                成的多聚糖，广泛分布于生物体内，由透明质酸合                            少，超声心动图提示小鼠心功能明显改善                    ［21-22］ 。上
                成酶合成 。研究显示纤维化组织中HA明显增多，                           述实验进一步证实了 S100A4 在心肌纤维化发生发
                        ［2］
                因此 HA 被认为是心肌纤维化的特征之一，作为心                          展过程中起到非常重要的作用。
                                                           ［3］
                肌纤维化的产物，被动参与纤维化的发生发展 。                                LMW⁃HA 与 CD44 结合后可以调控细胞增殖，
                近年来随着对 HA 研究的进一步深入，尤其是一些                          同时也已证明S100A4与心肌纤维化有关，因此我们
                研究证实 HA 不仅是纤维化的产物，更是作为纤维                          提出假设：LMW⁃HA 能够通过 CD44 作用于 S100A4
                化的驱动因子，促进成纤维细胞的分化与增殖，主                            蛋白，使其进入细胞核内，从而启动下游信号通路
                动参与心肌纤维化的发生发展              ［4-6］ 。上述研究发现，         参与心脏纤维化。
                HA 根据其不同的分子量而具有不同的功能，目前                               本研究旨在证明 LMW⁃HA 作为心肌纤维化的
                                 ［7］
                HA大致可分为3种 。初始合成的HA称为高分子                           驱动因子，能促进小鼠心脏成纤维细胞（cardiac fi⁃
                量透明质酸（high molecular weight hyaluronic acid，      broblasts，CF）的分化与增殖，并明确其与细胞膜表
                HMW⁃HA）（＞1 000 kDa），在生理状态下 HA 以                   面受体 CD44 结合后，能够诱导 S100A4 蛋白从胞浆
                HMW⁃HA 形式存在，在炎症刺激或病理状态下，                          进入细胞核内，最终促进心脏纤维化的发生，为针
                HMW⁃HA 在透明质酸酶作用下会降解为低分子量                          对HA和CD44的分子靶向治疗奠定基础。
                透 明 质 酸（low molecular weight hyaluronic acid，
                                                                  1  材料和方法
                LMW⁃HA）（6~20 kDa），后者是一种有生物活性的
                片段  ［8-10］ 。研究证实 HMW⁃HA 具有抗炎作用，保                  1.1  材料
                护细胞；LMW⁃HA 则有致炎作用，促进细胞增殖及                             LMW ⁃ HA HA60K ⁃ 1（Lifecore 公 司 ，美 国）；
                分化  ［9，11］ 。                                      DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶、
                    研究表明 LMW⁃HA 在细胞表面的特异性受体                       BSA（Gibco 公司，美国）；RIPA 裂解液、PMSF、DEPC
                为CD44，其广泛分布于包括成纤维细胞在内的多种                          水、DAPI染色液、抗荧光猝灭封片液、BCA蛋白浓度
                细胞中   ［12］ 。在白细胞中，CD44 与 LMW⁃HA 结合后               测定试剂盒、SDS⁃PAGE凝胶配置试剂盒、细胞核蛋
                仅 15 min 即被覆盖到细胞的一极，同时 HA 进入细                     白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（杭州碧云天公司）；青
                    ［9］
                胞内 。LMW⁃HA 与其受体 CD44 相结合后在调控                      霉素⁃链霉素混合物（HyClone公司，美国）；Ⅱ型胶原
                细胞增殖等方面起非常重要的作用                 ［13-14］ ，多项研究     酶（Worthington 公司，美国）；封闭用羊血清（北京中
                表明 CD44 与 LMW⁃HA 相互结合后可参与肺、肝脏                     杉金桥）；CCK⁃8细胞增殖⁃毒性检测试剂盒（DOJIN⁃
                及肾脏组织的纤维化病理进程中。细胞膜表面的                             DO 公司，日本）；抗HistoneH3、抗α⁃SMA（CST 公司，

                CD44 在膜相关金属蛋白酶（membrane⁃associated                美国），抗CD44（Abcam公司，美国），BRIC⁃235（ARP
                metalloprotease，MMP）作用下可以被水解，胞外段向                 公司，美国），抗 Collagen 3（上海 Proteintech 公司），
                血浆和细胞外液释放，而胞内结构域则被剪切下，                            抗 GAPDH、抗 S100A4、山羊抗兔 IgG⁃HRP、山羊抗
                通过核膜进入细胞核内，发挥相应的功能。近几年对                           小鼠 IgG⁃HRP（合肥 Biosharp 公司），AlexaFluor 488
                核型 CD44 的研究主要集中在肿瘤干细胞领域                   ［15］ ，  标记的羊抗兔 IgG、AlexaFluor 594 标记的羊抗小鼠
                研究提示当 CD44 转入细胞核内时可启动下游信                          IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，美国）；HiScript
                号，使得细胞发生程序重调，从而调控细胞分化与                            Ⅲ RT Super Mix for QPCR、Cham QSYBR qPCR Mas⁃
                增殖  ［13，16-17］ 。                                  ter Mix（上海诺唯赞公司）。
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