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第41卷第6期 潘晓娴，王彩虹，王 锃，等. B10细胞在放射性肺纤维化进程中的动态变化［J］.
2021年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：804-809 ·805 ·

胸部肿瘤是临床上常见的恶性肿瘤，而放射治 1.2.2 照射方式
疗是胸部肿瘤综合治疗必不可少的手段，如肺癌、 配制 4%水合氯醛以 0.1 mL/10 g 腹腔注射麻醉
食管癌、纵隔肿瘤等。放射性肺损伤是胸部肿瘤放 小鼠。将小鼠放入自制有机玻璃鼠笼中，拉直鼠
射治疗后常见的不良反应 ，包括早期的放射性肺 尾，胶布固定。根据本单位摆位误差以及质量控
［1］
炎和晚期的放射性肺纤维化（radiation⁃induced pul⁃ 制，将照射野设置为38.0 cm×1.5 cm，将固定好的小
monary fibrosis，RIPF） 。RIPF 一般发生于胸部放 鼠整齐排列置于治疗床上，照射部位为小鼠胸部，
［2］
疗的 6 个月后，临床表现包括呼吸困难、胸痛，严重 具体摆位操作参考已发表论文 。采用直线加速器
［9］
时可引起呼吸衰竭甚至死亡。目前 RIPF 的治疗靶 （Clinac600C/D）用6 MV⁃X线单次18 Gy照射小鼠全
标尚不明确，临床上缺乏有效的治疗措施 ，因此， 肺，射野角度 180°单野照射，剂量率 500 Mu/min。
［3］
寻找影响RIPF的靶标对于预防和治疗RIPF具有重 通过剂量体积直方图（dose volume histogram，DVH）
要意义。 评估计算出小鼠肺部百分深度剂量为 83%。对照
B10 细胞是一种可分泌 IL⁃10 的调节性 B 细胞 组相同环境下予以假照射。
（regulatory B cell，Breg）的特殊亚群，参与炎症、免疫 1.2.3 标本处理
［4］
性疾病、肿瘤等多种疾病 。近年多项研究证实 通过颈椎脱臼法处死各组小鼠，剪取小鼠左侧
B10 细胞与多种器官纤维化相关，如病毒引起的肝 肺组织，浸泡于 4%多聚甲醛中固定，24 h 后转至
纤维化 、粉尘性肺纤维化 、药物性肺纤维化 。 75%酒精，常规脱水，石蜡包埋，连续 0.4 μm 切片，
［5］
［7］
［6］
然而，粉尘及药物引起的肺纤维化与电离辐射引 通过HE染色、Masson染色、免疫荧光染色行病理学
起的肺纤维化机制不尽相同。前期研究发现，给 检测，显微镜下观察染色情况。另取小鼠整个脾脏
予 C57BL/6 小鼠次全身照射可引起脾脏中的 Breg 及相同质量同侧肺组织，浸泡于含 10%血清的 PBS
［8］
细胞亚群增加，抑制自身免疫性疾病的发展 。目 缓冲液中备用，待制备单细胞悬液。
前尚无研究报道 B10 细胞与 RIPF 相关联。本研究 1.2.4 流式细胞样本处理及流式分析
旨在观察小鼠经胸部电离辐射后，B10 细胞在小鼠 研磨组织样本，60 μm 细胞筛过滤脾脏/肺组
RIPF 进程中的动态变化情况，探讨 B10 细胞与 织，1 800 r/min（脾）、2 000 r/min（肺），离心5 min，弃
RIPF 之间可能存在的关联，为 RIPF 提供新的防治 上清，加入 5 mL 红细胞裂解液重悬后，以相同转速
思路。 离心 3 min 后，弃上清，5 mL PBS 缓冲液洗涤重悬，
离心5 mim，去上清，加入100 μL PBS缓冲液制备成
1 材料和方法
单细胞悬液。分别加入0.5 μL大鼠抗小鼠的FITC⁃
1.1 材料 CD19 抗体、APC⁃CD1d 抗体和 PE⁃CD5 抗体，混匀，
直线加速器（Clinac600C/D）（Varian医疗系统公 4 ℃下避光孵育 30 min。上机，于流式细胞仪上检
司，美国），流式细胞仪（Accuri C6）（BD公司，美国）； 测B10细胞数量占比情况。
大鼠抗小鼠CD5⁃PE（Sigma公司，美国），大鼠抗小鼠 1.2.5 病理学评分
CD19⁃FITC（BioLegend 公司，美国），大鼠抗小鼠 Masson染色评分标准：每张切片随机在上、下、
CD1d⁃APC（eBioscience 公司，美国），红细胞裂解液 左、右和中部各选 1 个视野，根据 Ashcroft 纤维化评
［10］
（BD公司，美国），60 μm细胞筛（北京索莱宝科技有 分标准对肺纤维化程度进行评分 。
限公司）。 免疫荧光评分标准：每张切片在高倍镜下随机选

1.2 方法 取5个视野，计数各个视野的阳性细胞数，采用阳性细
1.2.1 实验动物与分组 胞占视野总细胞数的百分比来评估表达情况。
选取 30 只成年雌性 6~8 周龄健康、清洁级 1.3 统计学方法
C57BL/6 小鼠，体重 18~22 g，购自上海斯莱克动物 实验结果采用SPSS 23.0统计软件分析，计量资
有限公司，许可证号：SCXK（沪）2007⁃0005。随机分 料数据以均数±标准差（x ± s）表示。方差齐性检验
成 5 组，分别为未照射（对照）组、照射后 2 d（IR2d） 采用F检验，对符合正态分布且方差齐的3组及3组
组、照射后14 d（IR14d）组、照射后3个月（IR3m）组， 以上的实验研究数据，如各组间 B10 细胞比例进行
照射后 5 个月（IR5m）组，每组 6 只。实验操作符合 单因素多水平方差分析，进一步使用 Dunnett 法
3R原则，经福建医科大学伦理委员会批准。 （Dunnett’s multiple comparisons test）行多重比较。