Page 71 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第6期 周如玉，平逸帆，张 元，等. 基于叠氮溴化丙锭结合高通量测序技术分析口腔综合治疗台水路系统中
2021年6月 活菌多样性的研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：847-855 ·849 ·
无菌操作，戴无菌手套手执三用枪枪柄，换上灭菌 同前。并通过D（260 nm）和 D（260 nm）/D（280 nm）评
三用枪头，空放三用枪水流30 s，用灭菌瓶收集所需 估提取DNA的浓度和质量。PCR产物用 QuantiFlu⁃
水样量，封口膜封口。采集另一椅位水样时更换另 or ⁃ST 蓝色荧光定量系统进行检测定量。由上海
TM
一灭菌过的三用枪头。所有水样立即送实验室进 美吉生物医药科技有限公司利用 Illumina Miseq
行下一步实验。 PE300 平台进行高通量测序及数据分析。在各样本
1.2.2 优化PMA前处理浓度 中的序列拼接一段barcode标签序列，用来区分样本
为确定在本研究中使用最佳PMA处理浓度，整 来源的信息。有效序列是指获得的原始序列中具
个研究过程中分析的所有样本都按照相同的方法 有完整的barcode标签序列。本次分析将barcode和
制备。根据前期实验检测的33台DCU水样结果，选 前引物（forward primer）序列去除，过滤 read 尾部质
择了污染最严重的7台DCU和污染最少的6台DCU 量值20以下的碱基；拼接序列的overlap区错配比率
作为研究对象。采集 DUWL 水样 1 800 mL，在微生 不得高于 20%；不允许 barcode 错配；引物错配数不
物实验室超净工作台中，涡旋震荡 15 s 后将样本平 得大于2。然后对有效序列进行数据优化及长度分
均分为9等份，每份200 mL。4 ℃ 6 000 r/min离心3 布统计。
min，收集菌体沉淀，1 mL 灭菌 ddH2O 重悬，收集至 1.3 统计学方法
1.5 mL灭菌EP管中。 通 过 Usearch 软 件 平 台（version 7.1，http：//
取5份重悬菌体样本，85 ℃水浴10 min，冰上冷 drive5.com/uparse/）在 97%的相似水平下对非重复
却 10 min，重复 1 次。随机抽取其中 1 份样品，在超 序列（剔除单序列）进行操作分类单元（operational
净工作台中，将热处理样本用接种环均匀涂布于 taxonomic unit，OTU）聚类；使用 R 软件绘制稀释曲
R2A 琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱中培养6 d，用于 线及 Alpha 多样性指数，采用 Wilcoxon 秩和检验进
验证热灭活细菌的效果。剩余4份样本分别标记为 行组间差异分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
D1~D4。热处理样本（D1~D4）中加入 PMA，使 PMA
2 结 果
的终浓度分别为 0、5、10、20 μmol/L。未热处理的
4 份重悬菌体样本标记为L1~L4，也依次加入PMA， 2.1 PMA最适浓度筛选结果
使 PMA 的终浓度分别为 5、10、20、30 μmol/L。所有 接种于R2A琼脂培养基的热处理样本，37 ℃培
8 份样本都混合均匀，避光静置处理10 min。样本置 养 6 d，未见菌落形成，证明热处理能有效杀死样本
于冰上，使用500 W的卤素灯在距光源20 cm处光照5 中的活菌。由图 1A 可知，对于热处理组水样，随着
min，光照交联时不断翻转样本，使其充分光照。 PMA 浓度的增加，条带逐渐变暗，PMA 终浓度为 20
PMA 处理后的悬浮液于 4 ℃ 12 000 r/min 离心 6 μmol/L时，条带完全消失。说明PMA能够与样本中
min，弃去上清液，使用细菌基因组DNA小量纯化试 死菌 DNA 发生反应并抑制其进行 PCR 扩增，终浓
剂盒按说明书提取样本中的细菌基因组DNA。 度20 μmol/L的PMA能够有效阻止所有死菌DNA的
PCR扩增目的片段：以提取的细菌基因组DNA PCR扩增。由图1B可知，对于未进行热处理的常规
为模板，采用细菌通用引物 515F（5′⁃GTGCAGC⁃ 水样，随着 PMA 浓度的增加，条带未见明显变暗或
MGCCGCGG ⁃ 3′ ）及 907R（5′ ⁃ CCGTCAATTC⁃ 消失。说明对于常规水样，即使增加 PMA 浓度至
MTTTRAGTTT⁃3′）对 16S rRNA 的 V4~V5 区 进 行 30 μmol/L 也不会影响正常活菌的 PCR 扩增。由此
扩增。 确定 PMA 处理 DUWL 水样的最适浓度为 20 μmol/
PCR 扩增反应程序：95 ℃预变性 3 min；；95 ℃ L。在这一浓度作用下，PMA 不影响活菌 DNA 的
变性 30 s，55 ℃下退火 30 s，72 ℃下延伸 45 s，27 个 PCR扩增，同时保证能抑制样本中死菌DNA的PCR
循环；最后在 72 ℃条件下延伸 10 min；4 ℃保存。 扩增。
PCR 反应结束后，每管均加 2 μL PCR 产物用于 2.2 Miseq测序检测结果
1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，利用GelDoc2000凝胶 2.2.1 样本测序结果及多样性指数
成像系统观察琼脂糖凝胶上的DNA条带。 33 个样本中共获得序列数 1 216 470 条，检测
1.2.3 33个样本DNA提取、PCR扩增制备及高通量 序列的质量及嵌合体，并比对 Silva 数据库，得到
测序 978 054条高质量序列。剔除barcode标签序列和前
最适PMA浓度预处理33个样本，DNA提取方法 引物序列获得的序列平均长度为396 bp。
