Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
               ·964 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


                                                                                          -/-
              protein expressions of SOD1 and SOD2，and decreased the protein expressions of p16 in the Bmi ⁃ 1 Chk2 -/-  mice significantly.
              Conclusion：Chk2 knockout can attenuate the brain aging phenotype induced by Bmi ⁃ 1 deficiency in mice by enhancing the
              antioxidant capacity.
             ［Key words］ brain；aging；Bmi⁃1；Chk2；antioxidant
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2021，41（07）：963⁃969］







                  B淋巴瘤Mo⁃MLV 插入区1（B cell⁃specific MLV           1.1.2 试剂
              integration site⁃1，Bmi⁃1）是转录抑制因子多梳基因                   兔抗NeuN 单克隆抗体（Abcam 公司，英国），小
                       ［1］
                                                    AFR
              家族成员 ，可通过抑制 p16           INK4a /Rb 和 p19 /p53 途  鼠抗GFAP 单克隆抗体（Millipore 公司，美国），兔抗
              径参与调节细胞周期和细胞衰老               ［2-3］ ，并在各种细胞        Iba1单克隆抗体（Abcam 公司，英国），兔抗p16多克
              的抗氧化防御中发挥重要作用              ［4-7］ 。Bmi⁃1在各类神       隆抗体（Santa Cruz 公司，美国），鼠抗 GAPDH 单克
              经细胞（包括神经干细胞、神经元和星形胶质细胞等）                          隆抗体（Proteintech 公司，美国），兔抗 SOD1、SOD2
              中均有表达，并在脑发育过程中具有重要作用                      ［8-9］ 。  单克隆抗体（Abcam 公司，英国）。羊抗鼠、羊抗兔
              既往研究显示，Bmi⁃1 在老年人脑和老年小鼠脑中                         IgG（武汉博士德公司），羊抗兔 IgG⁃HRP、羊抗小鼠
              表达下调，提示Bmi⁃1与大脑衰老有关 。通过对利                         IgG⁃HRP（KPL 公司，美国），Elite ABC Kit（Vector 公
                                                ［4］
              用基因重组技术建立的Bmi⁃1基因敲除（Bmi⁃1 ）小                      司，美国）。
                                                        -/-
              鼠的研究发现，Bmi⁃1 缺乏的小鼠出现成熟前衰老                         1.2  方法
              的表型，神经系统和造血功能缺陷                 ［10］ ，抗氧化能力       1.2.1 动物基因型鉴定
              降低 。                                                   将新生仔鼠剪尾（约5 mm），参见Miao等            ［2，13］ 方法
                  ［2］
                  细胞周期检查点激酶2（cell⁃cycle checkpoint ki⁃          结合PCR反应，鉴定小鼠基因型，引物序列见表1。
              nase 2，Chk2）是重要的 DNA 损伤检查点调节器              ［11］ ，
                                                                                表1  PCR引物序列
              当 Chk2 被激活时，能够迅速通过磷酸化，阻滞细胞                                 Table 1 Sequences of PCR primers
              周期进程，导致细胞发生程序性死亡                 ［12-13］ 。先前研      基因名称                引物序列（5′→3′）
                                        -/-
              究表明，敲除Chk2基因（Chk2 ）可以改善小鼠Bmi⁃                      Chk2⁃wt  正向引物：GACAACTACTGGTTTGGGAGAG
              1缺失引起的多器官表型，并延长其生存时间                     ［13-14］ ，          反向引物：AAAGTGCGATTTCAGAGTTGTTAC
              但 Chk2 基因敲除是否能纠正 Bmi⁃1 缺失小鼠的脑                      Chk2⁃ko  正向引物：GAGACAACCAAGCCATTCT
              衰老表型，尚未见文献报道。因此，我们通过配笼                                      反向引物：GGACCGCTATCAGGACAT
                                                                 Bmi1     正向引物：CAGTTAGGCAGTATGTAGTTTTC
              生 成 Bmi ⁃ 1 和 Chk2 双 基 因 敲 除 小 鼠（Bmi1        -/-
                                                                          反向引物：GTTGTGGTGGAGTGTAAGAGTGT
                  -/-
                                          -/-
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              Chk2 ），比 较 同 窝 WT、Bmi1 、Chk2 和 Bmi1          -/-
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              Chk2 小鼠不同脑区的表型及抗氧化酶等的表达变
                  -/-
                                                                          反向引物：GCAAGACCTGCCTGAAACCGAACT
              化，以进一步验证 Chk2 敲除是否可通过中断 DNA
              损伤应答途径，增强抗氧化能力，从而改善由Bmi⁃1                         1.2.2 组织取材及切片
              缺失所致的小鼠脑衰老表型。                                          采用 3%戊巴比妥钠（4 mg/100 g 体重）深度麻
                                                                醉小鼠后，经心脏行生理盐水灌洗，取脑，沿大脑纵
              1  材料和方法
                                                                裂切开分左右两半，左侧半脑经 4%多聚甲醛固定
              1.1  材料                                           后，梯度酒精脱水、石蜡包埋后行矢状位石蜡切片，
              1.1.1 动物                                          片厚 5 μm，右侧半脑分脑区冻存，用于提取组织蛋
                                    -/-        -/-         -/-  白进行Western blot实验。
                  实验用 2 月龄 Bmi1 小鼠、Chk2 小鼠、Bmi1
              Chk2 小鼠及同窝野生型（wild type，WT）对照小鼠                   1.2.3 免疫组织化学染色
                  -/-
              各6只，雌雄不限。动物饲养、管理及使用均严格按                                石蜡切片经37 ℃ 30 min烘干后，行常规脱蜡水
              照南京医科大学实验动物管理规范进行（IACUC：                          化，然后用 3%过氧化氢处理 30 min 以灭活内源性
              1809007）。                                         过氧化物酶，10％正常羊血清封闭 1 h，滴加一抗兔
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