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第41卷第7期 崔 敏，刘轶宁，庄旻羽，等. Chk2敲除可通过增强抗氧化能力改善由Bmi⁃1缺失所致的小鼠
2021年7月 脑衰老表型［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：963-969 ·965 ·

抗 NeuN 单克隆抗体（1∶200）、小鼠抗 GFAP 单克隆 脑区明显增加，而在大脑皮层虽有增加趋势，但差
抗体（1∶200）、兔抗 Iba1 单克隆抗体（1∶200）、兔抗 异无统计学意义；Bmi1 小鼠以上脑区的 Iba1 和
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p16多克隆抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜，加生物素标 NeuN 阳性率明显减少；与 Bmi1 小鼠相比，Bmi1 -/-
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记的羊抗鼠IgG（1∶100）、羊抗兔IgG（1∶100）室温孵 Chk2 小鼠以上脑区的 Iba1 和 NeuN 阳性率明显增
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育 1 h，滴加 Elite ABC 混合液室温孵育 30 min，加 加，但尚未达到WT小鼠水平（图1、2）。这些结果说
DAB 底物（武汉博士德公司）室温避光孵育5~8 min， 明Chk2敲除能够促进Bmi1 小鼠大脑皮层、海马及
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苏木精复染 20 s，1%盐酸酒精分色 2~3 s，流水蓝化 下丘脑区小胶质细胞的发育及神经元的分化与成熟。
3 min，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封 2.2 Chk2敲除可通过增强抗氧化能力缓解由Bmi⁃
片。正置显微镜采集图像，用 Image Pro Plus 6.0 软 1缺失所致的小鼠脑衰老表型

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件分析NeuN、Iba1、p16阳性细胞百分率（%），GFAP 为了研究Chk2敲除对Bmi⁃1 小鼠脑衰老表型
阳性面积百分率（%），每个动物每个相应脑区至少 的影响以及可能机制，我们采用免疫组化的方法检
计数3张切片，结果取平均值。 测了2月龄Bmi1 、Chk2 、Bmi1 Chk2 及同窝WT
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1.2.4 Western blot实验 对照小鼠脑中轻度反应型星形胶质细胞标志物
组织按质量/体积比约1∶20加入RIPA后剪碎、匀 GFAP及衰老指标p16的表达情况。结果显示，与同
浆，冰上静置30 min，13 000 r/min 4 ℃离心15 min，提 窝 WT 小鼠相比，Bmi1 小鼠、Bmi1 Chk2 小鼠海
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取蛋白并用BCA法进行定量，100 ℃金属浴10 min， 马和下丘脑区均出现GFAP阳性星形胶质细胞的激
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使蛋白变性后置-80 ℃冰箱保存。10% SDS⁃PAGE 活，且胞体肥大、表达增强，而 Bmi1 Chk2 小鼠的
胶，每组蛋白加样 20 μg，110 V 恒压电泳 2 h 后， GFAP 阳性率明显低于Bmi1 小鼠，但尚未达到WT
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280 mA 恒流转膜 90 min，蛋白湿转至硝酸纤维素膜 小鼠水平（图 3）。与 WT 小鼠相比，p16 阳性细胞百
上，含5% 脱脂奶粉的PBST 37 ℃封闭1 h，加入适量 分率及蛋白表达量在 Chk2 小鼠大脑皮层、海马区
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一抗：鼠抗 GAPDH 单克隆抗体（1∶2 000）、兔抗 及下丘脑区虽有减少趋势，但差异无统计学意义；
SOD1、SOD2单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗p16多克隆 而Bmi1 小鼠以上脑区的p16阳性率及蛋白表达量
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抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PBST洗涤后，加入相 均明显增加；与 Bmi1 小鼠相比，Bmi1 Chk2 小鼠
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应特异性二抗（1∶2 000），摇床室温反应 1 h。洗膜 以上脑区的p16阳性率显著降低，但尚未达到WT小
后，滴加ECL发光混合液，自动成像仪曝光，保存显 鼠水平（图 4、5）。这些结果说明 Chk2 敲除能够缓
影图像。采用Image⁃Pro Plus 6.0软件进行分析， 解由Bmi⁃1缺失所致的小鼠衰老表型。
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1.3 统计学方法 采用Western blot验检测2月龄Bmi1 、Chk2 、
采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析及 Bmi1 Chk2 及同窝WT对照小鼠大脑皮层SOD1及
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作图。各组计量数据以均数±标准差（x ± s）表示。 SOD2 的表达量，结果显示，与同窝 WT 小鼠相比，
采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）进行多组间 SOD1 和 SOD2 蛋白表达量在 Chk2 小鼠脑内明显
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数据比较，多组间数据两两比较用SNK法，P < 0.05 增加，而在 Bmi1 小鼠和 Bmi1 Chk2 小鼠脑内则
为差异有统计学意义。 明显减少（图 5）；与 Bmi1 小鼠相比，Bmi1 Chk2 -/-
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小鼠脑内的SOD1和SOD2蛋白表达量显著上调，但
2 结 果
尚未达到WT小鼠水平（图5）。以上结果说明，Chk2
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2.1 Chk2敲除可促进Bmi⁃1 小鼠不同脑区小胶质 敲除可通过增强抗氧化能力缓解由Bmi⁃1缺失所致
细胞的发育以及神经元的分化与成熟 的小鼠脑衰老表型。
为了明确Chk2敲除对Bmi⁃1 小鼠小胶质细胞
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3 讨 论
发育以及神经元分化、成熟的影响，我们采用免疫
组化的方法检测小胶质细胞标志物 Iba1、神经元特 衰老在生命进程中是一个不可逆的过程，但有
异性核蛋白NeuN的表达，分析比较了2月龄Bmi1 、 希望通过增强或减弱某些基因的功能来延缓它的
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Chk2 、Bmi1 Chk2 及同窝 WT 对照小鼠大脑皮 进程 ［15］ 。既往研究表明，Chk2 敲除可以部分挽救
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层、海马及下丘脑区Iba1、NeuN阳性细胞百分率的 Bmi⁃1缺失小鼠的相关表型 ［16］ ，但对于Bmi⁃1缺失小
变化。结果显示，与同窝 WT 小鼠相比，Iba1 和 鼠脑衰老表型的影响尚不明确。故本实验中，我们
NeuN 阳性细胞百分率在 Chk2 小鼠海马区及下丘 通过比较Bmi⁃1和Chk2双基因敲除的Bmi1 Chk2 -/-
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