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第41卷第7期         肖  逸，王胜婵，王易欣，等. TLR/NF⁃κB信号通路在甲基苯丙胺诱导的原代小胶质细胞炎性
                  2021年7月              反应中的作用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：970-975                   ·971 ·


                    甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）是一种                1.2.2 免疫荧光染色
                                                 ［1］
                具有强烈神经毒性的苯丙胺类兴奋剂 。研究表明，                               4%多聚甲醛固定原代小胶质细胞 30 min，1%
                METH的神经毒性与小胶质细胞的激活有关 。小胶                          的 Triton X⁃100 冰上透化 5 min，10%山羊血清 37 ℃
                                                      ［2］
                质 细 胞 是 中 枢 神 经 系 统（central nervous system，       封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃避光孵育
                CNS）中最重要的免疫细胞，正常情况下，小胶质细                          2 h，加入含防荧光淬灭液的DAPI复染，激光共聚焦
                胞处于静息状态，而受到有害刺激后，小胶质细胞                            显微镜下扫描。所有结果至少重复3次。
                被激活，释放出肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis fac⁃               1.2.3 蛋白免疫印迹实验
                tor⁃ α，TNF⁃α）、白介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）、           用蛋白裂解液（内含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑
                                                     ［3］
                白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）等炎症因子 。小胶                制剂）裂解原代小胶质细胞，提取总蛋白，采用BCA
                质细胞发生持续的激活，可导致其周边神经组织的                            法测定蛋白质浓度。电泳（浓缩胶电泳 40 V，分离
                炎症损伤。Toll样受体（Toll like receptor，TLR）在小            胶电泳90 V），转膜（200 V，1 h），封闭（5%脱脂奶粉
                胶质细胞中广泛表达，该受体家族激活后作用于下                            溶液，2 h），一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，将
                游炎性信号分子，促使编码炎症的相关分子及细胞                            PVDF膜与ECL发光液A液和B液（1∶1）混合，置于化
                因子的基因转录       ［4-5］ 。然而，TLR是否参与METH引              学发光成像系统进行曝光。所有结果至少重复3次。
                起的神经炎性反应尚不清楚。                                     1.2.4 Real⁃time PCR
                    本研究通过建立原代小胶质细胞METH染毒模                             提取原代小胶质细胞的 mRNA 后，按照 Prime⁃
                型，旨在探讨TLR及其下游炎性信号及因子介导的                           Script TM  RT Reagent Kit 反转录试剂盒说明书，将
                炎性反应，从而为METH的干预提供潜在靶点。                            mRNA 逆转录成 cDNA，设计引物（引物序列见表
                                                                  1），冰上配制反应体系，设置ABI7300荧光定量PCR
                1  材料和方法
                                                                  仪反应程序（两步法）：96 ℃ 30 s 预变性，95 ℃ 5 s，
                1.1  材料                                           60 ℃ 34 s，40次循环。每个样品4个复孔，利用熔解
                    METH（中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 ，纯 度 ：             曲线确定PCR产物是否单一，根据标准曲线得出扩
                99.9%），PrimeScript RT Reagent Kit 反转录试剂盒          增效率。以β⁃actin作内参，用2          -ΔΔCT 法对结果进行计
                                 TM
               （TaKaRa 公司，日本），小鼠 IBA⁃1 单克隆抗体（Pro⁃                 算和分析。ΔΔCT=（CT1-CT2）-（CT3-CT4），CT1：处理
                teintech 公 司 ，美 国），小 鼠 Phospho ⁃ NF ⁃ κB p65      样品待测基因的临界循环数，CT2：处理样品管家基
               （Ser536）单克隆抗体、兔 NF⁃κB p65（D14E12）单克                因的临界循环数，CT3：对照样品待测基因的临界循
                隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国），HRP          环数，CT4：对照样品管家基因的临界循环数，所有结
                标记的羊抗兔 IgG（H+L）及 HRP 标记的羊抗小鼠                      果至少重复3次。
                IgG（H+L）（Jackson Immuno 公司，美国），磷酸酶抑               1.3  统计学方法
                制剂（Roche 公司，瑞士），细胞裂解液、蛋白酶抑制                           利用 SPSS20.0 软件对实验结果进行统计学分
                剂、小鼠β⁃actin 单克隆抗体（Sigma 公司，美国），                   析，各组数据用均数±标准差（x ± s）表示，多组定量
                PVDF膜、ECL发光液（Millipore公司，美国）。                     资料比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）检
                1.2  方法                                           验，多组间数据两两比较用Dunnett t检验，两组定量
                1.2.1 原代小胶质细胞培养                                   数据比较用 Student’s t 检验，用 Graphpad Prism5 软
                    孕18 d SD大鼠（购买于南京医科大学实验动物                      件进行作图。P < 0.05为差异具有统计学意义。
                中心），麻醉后断头，无菌条件下取出腹中胎鼠，分
                                                                  2  结 果
                离出两侧的大脑半球皮质，去除脑膜后置于 HBSS
                液，胰酶消化后依次经 100 μm 和 40 μm 网筛过滤，                   2.1  小胶质细胞的鉴定与纯度分析
                将 3×10 个细胞接种于含 18 mL DMEM 培养液（内                       小胶质细胞培养至第 10~14 天，在恒温水平摇
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                含 10%胎牛血清、1%双抗、0.04 mg/mL 巨噬细胞                    床上 37 ℃，260 r/min 摇晃 2 h，收集悬浮细胞，放入
                集落刺激因子）的 75 cm 培养瓶中，接种 4 d 后半                     CO2恒温培养箱培养2~3 d后，利用免疫荧光方法对
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                量更换培养液，以后每隔 3 d 换 1 次培养液。本研                       原代培养细胞进行鉴定与纯度分析。如图 1 所示，
                究南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会批                             红色荧光显示的是IBA⁃1阳性细胞，IBA⁃1是小胶质
                准（批准号：IACUC⁃1801008）。                             细胞的特异性激活标志蛋白，主要分布于细胞体。
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