Page 64 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 64

第41卷第7期
               ·994 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


                             表1 PCR引物序列                         法显影并拍照。
                       Table 1 Primer sequences for PCR         1.3  统计学方法
                  基因                 引物序列（5′→3′）                     应用SPSS 20.0进行数据的统计分析，计量资料
                LINC01197     F：TTTAAGCACACAGAGGCGGA
                                                                采用均数±标准差（x ± s）描述，两组间均数比较采用
                              R：GGGAATGGAATGGAGGACTGG
                                                                t检验，多组计量资料比较先采用单因素方差分析再
                β⁃actin       F：CATGTACGTTGCTATCCAGGC
                                                                以LSD检验进行两两比较，CCK⁃8实验结果采用重
                              R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT
                                                                复测量的方差分析，生存数据采用 Kaplan⁃Meier 方
                SERPINA1      F：TATGATGAAGCGTTTAGGC
                                                                法分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。
                              R：TTTCCAGGTGCTGTAGTTT
                APOA2         F：CTGTGCTACTCCTCACCATCT
                                                                2  结 果
                              R：CTCTCCACACATGGCTCCTTT
                IGF2          F：TGCTGCATTGCTGCTTACC             2.1  LINC01197 在胃癌组织中表达增高且与胃癌
                              R：CCACAGACGAACTGGAGGG             患者预后差相关
              接种于96孔培养板，每孔200 μL细胞悬液，分别置                             对 GEPIA 数据库中 408 个胃癌组织样本和 211
              于培养箱培养 24~120 h 后，吸去培养液，每孔加入                      个正常胃部组织样本的分析结果表明，LINC01197在
              提前配制的 10% CCK⁃8 溶液 100 μL，1~2 h 后于波               胃癌组织中的表达量明显增高（图 1A）。分析发现
              长 450 nm 测各孔吸光度值（每组设 5 个平行孔，独                     LINC01197低表达的患者总生存期（中位时间：低表
              立重复 3 次）。每日加 CCK⁃8 和加液后测吸光度时                      达组75.5个月，高表达组40.0个月）、首次进展时间
              间相同，重复5 d后绘制增殖曲线。                                 （中位时间：低表达组 50.0 个月，高表达组 24.3 个
              1.2.6 Transwell侵袭实验                               月）和进展后生存期（中位时间：低表达组 13.8 个
                  取出Transwell侵袭小室置于24孔板中，小室上                    月，高表达组 9.7 个月）均显著长于高表达患者，且
              层加入无血清 RPMI1640 200 μL，下层加入有血清                    差异均具有统计学意义（图1B~D）。选取21对胃癌
              RPMI1640 600 μL。消化目的细胞后计数，取 4×10              4   和匹配的癌旁组织，通过qPCR实验证实LINC01197
              个细胞滴入小室上层，置于培养箱孵育24 h，取出小                         在胃癌组织中的表达量明显高于癌旁组织（图
              室，4%多聚甲醛固定20 min，用棉签擦去上层细胞，                       1E）。最后，我们分析了 LINC01197 在胃癌细胞内
              结晶紫染色15 min，蒸馏水轻轻冲洗，在显微镜下计                        的表达水平，结果显示LINC01197在人胃黏膜上皮
              数 5 个高倍镜视野下的穿膜细胞数，计算穿膜细胞                          细胞GES⁃1中的表达显著低于人胃癌细胞株 SGC⁃
              平均值，评估细胞侵袭能力。                                     7901、BGC⁃823、MGC⁃803和AGS（图1F）。
              1.2.7 克隆形成实验                                      2.2  在体外和体内实验中敲减 LINC01197 能抑制
                  取对数生长期1×10 个细胞，制成单细胞悬液，每                      胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移
                                   5
              孔100 μL加入6孔板，3 d换1次液，培养10~14 d后，                       为了研究 LINC01197 在胃癌细胞中的作用，我
              用结晶紫粉末和甲醛配成 0.5%结晶紫染色液染色                          们在 SGC⁃7901 和 BGC⁃823 细胞系中通过短发夹
              15~30 min，PBS冲洗后拍照。                               RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲减了 LINC01197
              1.2.8 裸鼠皮下成瘤实验                                    的表达（图 2A）。相比较 NC 组，shLINC01197 组胃

                  于4周BALB/C裸鼠皮下分别注射BGC⁃823 NC                   癌细胞增殖减缓（图 2B）。克隆形成实验的结果进
                                                            6
              和BGC⁃823 shLINC01197细胞，每只接种细胞5×10                 一步证明了这一现象（图2C）。与此同时，Transwell
              个，每3 d观察肿瘤大小，2周后取出肿瘤并称重、测                         实验的结果表明敲减LINC01197也抑制了胃癌细胞
              量大小。包埋肿瘤并做免疫组化切片。                                 SGC⁃7901和BGC⁃823的侵袭及迁移能力（图2D）。
              1.2.9 蛋白免疫印迹实验                                         为了进一步验证 LINC01197 在胃癌中的功能，
                  当胃癌细胞状态良好时，吸取培养液，PBS漂洗                        我们研究了LINC01197在动物体内肿瘤形成中的作
              2遍。加入细胞裂解液，低温离心5 min，取上清，并                        用。敲减了 LINC01197 后的 BGC⁃823 shLINC01197

              进行蛋白定量。蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃                          细胞及阴性对照BGC⁃823 NC 细胞分别被注射到裸
              PAGE），湿转法转膜，并用 5%脱脂奶粉溶液封闭                         鼠皮下，定期测量肿瘤生长变化，2周后将皮下肿瘤
              后，分别孵育β⁃actin、SERPINA1 抗体过夜，次日用                   取出测量并进行了 Ki⁃67 免疫组化分析。结果显
              PBST 洗膜，常温孵育二抗 2 h，PBST 漂洗后用 ECL                  示，相比较 NC 组，shLINC01197 组胃癌细胞体内增
   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69