Page 29 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 29

第41卷第8期                程照翔，方 超，吕纯业. 抑制PP2Acα促进胃癌进展中WTAP高表达［J］.
                  2021年8月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1128-1134                      ·1131 ·


                2.2  抑制 PP2Acα可导致 WTAP 的 mRNA 及蛋白水                组（图 2A）进行嘌呤毒素筛选，获得了稳定低表达
                平升高                                               PP2Acα的胃癌细胞。并在 mRNA 及蛋白水平验证
                    为了探究PP2Acα与WTAP之间的关系，通过慢                      敲减成功（图 2B、C）。对稳定转染的胃癌细胞进行
                病毒介导的 shRNA 敲减胃癌细胞 BGC⁃823 中的                     RT⁃qPCR、Western blot 实验，发现抑制 PP2Acα后，
                PPP2CA，抑制PP2Acα的表达。慢病毒转染48 h后，                    胃癌细胞BGC⁃823中的WTAP的mRNA及蛋白水平
                对荧光表达较强的 Control 组、shRNA1 组、shRNA3                均明显升高（图2B、C）。

                 A           Control               shRNA1                 shRNA2                 shRNA3











                            B                    *      control  C       Control  shRNA1  shRNA3
                               mRNA相对表达 2.0  *          shRNA3     PP2Acα                      36 kDa
                                                        shRNA1
                                 1.5
                                 1.0
                                                                                               45 kDa
                                                                    WTAP
                                 0.5
                                 0.0                                β⁃actin                    42 kDa
                                      PPP2CA   WTAP
                   A：通过慢病毒介导的shRNA（可表达绿色荧光）敲减胃癌细胞BGC⁃823的基因PPP2CA，抑制PP2Acα表达（×100）；B：抑制PP2Acα后，RT⁃
                qPCR检测BGC823中WTAP mRNA的表达量；C：抑制PP2Acα后，Western blot检测BGC⁃823中WTAP蛋白的表达量。与对照组相比，P < 0.05。
                                                                                                        *
                                       图2 在骨癌细胞BGC⁃823中抑制PP2Acα对WTAP表达的影响
                            Figure 2 Inhibition of PP2ACα could influence WTAP levels in gastric cancer cell BGC⁃823


                2.3  体外实验表明抑制PP2Acα促进胃癌细胞的增                       2.5  探究PP2Acα与WTAP二者之间的联系
                殖、迁移与侵袭                                               通 过 蛋 白 互 作 功 能 富 集 分 析 网 站 STRING
                    为了探究抑制 PP2Acα对胃癌细胞的影响，在                      （https：//string⁃db.org/），查询 PP2Acα与 WTAP 二者
                离体条件下进行了多种表型实验。抑制 PP2Acα                          之间的联系。发现 PP2Acɑ通过整合因子复合体亚
                后，胃癌细胞出现明显的上皮间充质转化（EMT）特                          基 5（integrator complex subunit 5，INTS5）、RNA 聚合
                征，即细胞形态向梭形改变，同时细胞之间变得松散                           酶Ⅱ亚基 2（RNA polymerase Ⅱ subunit B，POLR2B）
               （图3A）；克隆形成实验（图3B）发现shRNA1、shRNA3                   与 WTAP 建立联系（图 5A）。但是数据库显示的证
                组的增殖能力均较 Control 组明显上升（P < 0.01）。                 据不足以明确 PP2Acɑ通过 INTS5、POLR2B 调控
                以相同的细胞密度在ibidi小室内铺板，于贴壁后的                         WTAP 的表达或功能。为了明确 PP2Acɑ与 WTAP
                0 h、12 h、24 h观察划痕愈合情况，发现shRNA1组、                  之间的调控关系，又通过磷酸化位点网站 Phospho⁃
                shRNA3 组的愈合能力在 12 h 时已显著快于 Control                site（http：//www.phosphosite.org）查询 WTAP 的磷酸
                组（图 3C）；且 Tanswell 侵袭实验也发现在培养 24 h                化修饰情况，发现 WTAP 的氨基酸序列存在大量磷
                后，实验组的侵袭能力明显强于对照组（P < 0.01，                       酸化位点（图 5B）。这也意味着 WTAP 上的磷酸化
                图 3D）。上述表型实验证明了抑制 PP2Acα可以促                       修饰可能会受到PP2Acα的调控，进而影响WTAP的
                进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。                                 功能与表达。
                2.4 在体实验表明抑制PP2Acα促进胃癌细胞的增殖
                                                                  3  讨 论
                    将稳定转染的胃癌细胞接种到4周龄雌性裸鼠
                的腋下（n=4）。4 周后，处死所有裸鼠，并分离出肿                            PP2A 全酶是由结构亚基A（65 kDa），调节亚基
                瘤。结果表明，实验组肿瘤体积较对照组明显增加                            B（50~130 kDa）和催化亚基 C（36 kDa）组成的异源
               （P < 0.01，图 4）。裸鼠成瘤实验表明在活体层面，                      三聚体。催化亚基C为PP2A全酶的核心结构，具有
                抑制PP2Acα可以促进胃癌细胞的增殖。                              2个亚型：PP2Acα（由PPP2CA基因编码）和PP2Acβ
   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34