Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第8期
               ·1136 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年8月


                                     ［4］
              亡，但具体机制尚未探明 。二甲双胍（Metformin，                      CCK⁃8 反应试剂，继续置于培养箱孵育1 h后，酶标
              Met）是一种胰岛素增敏剂，临床上主要用于治疗 2                         仪于450 nm检测各孔吸光度。本实验中Met 的浓度
              型糖尿病 。近年来的一些研究发现，除降低血糖                            梯度参考以往的文献         ［7-8］ 设置。
                      ［5］
              外，Met还可通过降低促炎因子表达水平、激活腺苷                          1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
              酸活化蛋白激酶途径、抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白                                取对数生长期 KGN 细胞，胰酶常规消化后以
                                                      ［6］
              合成通路、抑制氧化应激等机制发挥抗炎作用 。但                           6×10 个/孔培养于 6 孔板内，每组设置 3 个复孔，预
                                                                     4
              目前对于Met能否改善炎症因子导致的卵巢颗粒细                           培养 1~2 d；各处理组中分别加入相应浓度的细胞培
              胞的细胞功能损伤尚不清楚。本研究旨在探讨Met                           养液，处理 KGN 细胞 48 h 后，用不含 EDTA 的胰酶
              对IFN⁃γ诱导的KGN细胞功能损伤的潜在保护作用                         消化收集细胞，并用预冷的 PBS 洗涤 2 遍。用标记
              及其可能机制。                                           细胞凋亡的结合缓冲液调节 KGN 细胞浓度为 5×

                                                                  5
                                                                10 个/mL。在100 μL细胞悬液中加入1 μL Annexin
              1  材料和方法
                                                                V⁃APC和2 μL 7⁃AAD；混匀，室温避光孵育15 min。
              1.1  材料                                           用结合缓冲液洗去未结合抗体，再用200 μL预冷的
                  实验细胞株人卵巢颗粒细胞KGN细胞（上海江                         PBS重悬细胞，流式细胞仪分析细胞凋亡。
              林生物科技有限公司）；IFN⁃γ（上海达科为生物技术                        1.2.4 细胞周期检测

              有限公司）；Met（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；CCK⁃8                   各处理组中分别加入相应浓度的细胞培养液
              检测试剂盒（上海碧云天生物公司）；细胞周期试剂                           处理KGN细胞72 h后，收集细胞并用预冷的PBS洗
              盒（上海前尘生物科技有限公司）；细胞凋亡检测试                           涤 2 遍；加入 2 mL 70%预冷乙醇固定细胞，轻轻混
              剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；TRIzol RNA 提                     匀，4 ℃过夜；离心去除固定液，用预冷的 PBS 洗涤
              取试剂、逆转录试剂和Real Time PCR 试剂（TaKaRa                 细胞 2~3 次，离心，弃上清；按照细胞周期试剂盒说
              公司，日本）；DMEM（上海源培生物公司）；胎牛血清                        明书，分别加入 100 μL 试剂 A（胰蛋白酶等），轻轻
             （Nobimpex 公司，德国）；青霉素、链霉素和胰酶（Sig⁃                   混匀，室温放置 10 min；加入 100 μL 试剂 B（RNA
              ma⁃Aldrich 公司，美国）。细胞培养箱（Thermo 公                  酶、胰酶抑制剂等）轻轻混匀，室温放置10 min；加入
              司，美国）；生物安全柜（青岛海尔生物医疗公司）；                          150 μL 试剂 C（碘化丙啶等）轻轻混匀，室温放置
              倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；超高速低温离心                      15 min。上机前用 300 目尼龙筛网过滤细胞液，用
              机（Beckman Coulter 公司，美国）；酶标仪（Ｒayto 公              流式细胞仪检测细胞周期。
              司，美国）；流式细胞仪 CytoFLEX（Beckman Coulter              1.2.5  q⁃PCR检测细胞周期负性调节蛋白CDKN1A
              公司，美国）。                                           mRNA的表达
              1.2  方法                                                TRIzol法提取各处理组的KGN 细胞总RNA，按
              1.2.1 细胞培养                                        照日本TaKaRa公司的逆转录试剂说明书将RNA逆
                  人卵巢颗粒细胞 KGN 细胞培养于含 10%胎牛                      转录为 cDNA，置-20 ℃保存。以β⁃actin 为内参基
              血清的DMEM中，并加入终浓度为100 U/mL的青霉                       因，qRT⁃PCR 反应体系（20 μL）：2×TB Green Master
              素和链霉素，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养，                      Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各
              每48 h换1次新鲜培养液。                                    0.4 μL，无菌蒸馏水7.2 μL。反应程序：95 ℃预变性
              1.2.2 CCK⁃8法检测KGN细胞活力                             30 s，95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共
                  实验分组：对照组、IFN⁃γ处理组、Met 低/中/高                   进行 30 个循环。RNA 引物由上海生工生物工程有
              浓度梯度组、IFN⁃γ与 Met 低/中/高浓度梯度共处理                     限 公 司 合 成 。 β ⁃ actin：正 义 5′ ⁃ TCTGGCACCA⁃
              组。取处于对数生长期 KGN 细胞，用胰酶常规消                          CACCTTCTA⁃3′，反义 5′⁃AGGCATACAGGGACAG⁃
              化，将KGN细胞按3×10 个/孔，接种至96孔板，每组                      CAC ⁃ 3′ ；CDKN1A：正 义 5′ ⁃ CTCATCCCGTGTTC ⁃
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              设置5个复孔，置于37 ℃培养箱过夜预培养。第2天                         TCCTTT⁃3′，反义5′⁃GTACCAC⁃CCAGCGGACAAGT⁃
              对照组常规换液，各处理组则根据分组要求，分别                            3′。通过公式 2      -ΔΔCT 计算基因的相对表达量。所有
              加入含IFN⁃γ（250 ng/mL）和Met（1、10、100 μmol/L）          实验重复3次。
              的细胞培养液。将细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培                       1.3 统计学方法
              养箱，分别培养 24、48 和 72 h 后，每孔加入 10 μL                      实验结果数据使用 Graphpad Prism 5 软件进行
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