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第41卷第8期 程照翔，方 超，吕纯业. 抑制PP2Acα促进胃癌进展中WTAP高表达［J］.
2021年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1128-1134 ·1129 ·
丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 2A（protein phosphatase 然后用嘌呤霉素筛选出阳性表达的细胞，嘌呤霉素
2A，PP2A）作为人体细胞中占比最高的磷酸酶，在恶 筛选浓度为 2 μg/mL。实验所用 shRNA 序列如下：
性肿瘤的发生和转移过程中发挥重要的作用，通常 sh⁃PPP2CA⁃1，5′⁃GATCCGTGGAACTTGACGATA⁃
［1］
被作为一种抑癌因子进行研究 。流行病学调查显 CTCTAACTCGAGTTAGAGTATCGTCAAGTTCCATT⁃
示，作为 PP2A 核心基础的催化亚基α亚型 PP2Acɑ， TTTT⁃3′；sh⁃PPP2CA⁃2，5′⁃GATCCGCAGATCTTCT⁃
［2］
其编码基因PPP2CA突变与胃癌发生相关 。 GTCTACATGGTTCAAGAGACCATGTA ⁃ GACAGAA⁃
N6⁃甲基腺苷（N6⁃methyladenosine，m6A）修饰 GATCTGCTTTTTTG⁃3′；sh⁃PPP2CA⁃3，5′⁃GATCCG⁃
是细胞中最为重要且保守的 RNA 修饰 ［3］ 。生物 GCAAATCACCAGATACAAATTTCAAGAG ⁃ AATTT⁃
信息学研究表明，作为 m6A 甲基转移酶复合物的 GTATCTGGTGATTTGCCTTTTTTG⁃3′。
桥接蛋白 WTAP，其高表达与胃癌的不良预后密 1.2.3 定量逆转录PCR
［4］
切相关 。 使用 RNA 抽提试剂盒（离心柱式）从培养的胃
PP2A可以通过抑制细胞 ⁃ 髓细胞症病毒性癌基 癌细胞中分离总 RNA，然后使用 Hiscrip RT 试剂
®
因（cellular⁃myelocytomatosis viral oncogene，c⁃Myc）、 盒，按照手册将 1 μg 总 RNA 反转录为 cDNA。使用
B 细胞淋巴瘤/白血病⁃2 基因（B⁃cell leukemia/lym⁃ 分光光度计测量 RNA 的浓度。用荧光定量 PCR 试
phoma 2，BCL）等癌基因或者癌蛋白的表达 ［5-7］ ，从而 剂 盒 在 ABI StepOnePlus 实 时 PCR 系 统 上 进 行
TM
发挥抑癌作用；WTAP 却往往会上调癌基因或者癌 qPCR 实验。引物序列如下：GAPDH，5′⁃GGAGC⁃
蛋白的水平 ［8-11］ 。二者在恶性肿瘤中均扮演重要角 GAGATCCCTCCAAAAT⁃3′（正向引物），5′⁃GGCT⁃
色，但作用大相径庭，而且在胃癌中均无相关基础 GTTGTCATACTTCTCATGG⁃3′（反向引物）；WTAP，
研究，并缺乏相互关系的探索。因此，本文着重于 5′⁃CTTCCCAAGAAGGTTCGATTGA⁃3′（正向引物），
研究抑制 PP2Acα是否会影响胃癌细胞的恶性表 5′ ⁃ TCAGACTCTCTTAGGCCAGTTAC ⁃ 3′（反 向 引
型，以及在此过程中WTAP的表达。 物）；PPP2CA，5′⁃CAAAAGAATCCAACGTGCAAG⁃
AG⁃3′（正向引物），5′⁃CGTTCACGGTAACGAACCTT⁃
1 材料和方法
3′（反向引物）。
1.1 材料 1.2.4 蛋白免疫印迹分析
人胃癌细胞系 BGC⁃823（人胃腺癌细胞，低分 将蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液、1％
化，上海碧云天生物公司）；慢病毒（上海凯基生物 磷酸酶抑制剂混合物加入胃癌细胞中，冰上裂解
公司）；结晶紫染液（上海碧云天生物公司）；PCR引 30 min，提取蛋白质。使用蛋白定量试剂盒（BCA
物（南京金斯瑞生物公司）；划痕小室（易必迪公司， 法）对各组蛋白浓度进行检测。在进行Western blot
德国）；侵袭小室（康宁公司，美国）；RNA 抽提试剂 实验之前，将5×SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液按比例加
盒（离心柱式，上海碧云天生物公司）；RT⁃qPCR 试 入蛋白裂解物，煮沸10 min后放入-20 ℃冰箱保存。
剂盒（南京诺唯赞生物公司）；抗 PP2A⁃Cα/β抗体 取蛋白提取物（30~50 μg）用于预制胶电泳，电泳结束
（Santa Cruz 公司，美国）；抗 WTAP 抗体（Proteintech 后用PVDF膜进行转膜，然后用5％脱脂奶粉溶液室
公司，美国）；抗β⁃actin抗体（Santa Cruz公司，美国）； 温下封闭 1 h。TBST 轻微漂洗封闭液后与稀释后
二抗（Rockland公司，美国）。 的一抗（β⁃actin、PP2Acα、WTAP 一抗的稀释比例
1.2 方法 均为 1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜，第2天与相应稀释
1.2.1 细胞培养 后的二抗（二抗稀释比例为1∶10 000）在室温下孵育
人胃癌细胞系 BGC⁃823，在补充有 10％胎牛血 1 h，最后在暗室中滴加适量显影液后进行曝光条带。
清和1％青霉素/链霉素的培养基中培养。各组细胞 1.2.5 克隆形成
均在37 ℃、5％CO2加湿培养箱中培养。 将稳定转染的胃癌细胞以每孔1 000个细胞的
1.2.2 慢病毒介导的shRNA转染细胞 密度接种到 6 孔板中，并培养 2~3 周，弃去培养基，
根据 BGC⁃823 的感染复数值（multiplicity of in⁃ PBS洗涤2遍，然后将形成的细胞团用4%多聚甲醛
fection，MOI），BGC⁃823细胞的MOI值为100，用慢病 固定 15 min，最后结晶紫染色 20 min。拍摄细胞团
毒介导的shRNA转染胃癌细胞，敲减PPP2CA基因， 成像，并用 Image J 1.8.0 软件计数细胞团数。所有
进而抑制 PP2Acα的表达。转染 48 h 后收获细胞。 实验均一式3份进行，并重复至少3遍。
