Page 52 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第8期
·1154 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年8月

以上。然后将细胞均匀铺入含基质胶的96孔板中， 表1 胎盘样本的临床信息
4 Table 1 Clinical characteristics between preeclampsia
每组 3 个实验重复孔，每孔 3×10 个细胞。培养 6~
12 h 后置于倒置显微镜 100 倍视野下观察，计数管 and healthy pregnancies （x ± s）
腔形成数量。实验独立重复3次。 指标 子痫前期组 正常孕妇组 P值
年龄（岁） 30.17 ± 4.1600 29.67 ± 5.9200 >0.05
1.2.10 qPCR
孕妇BMI（kg/m） 26.32 ± 3.4100 25.82 ± 2.0700 >0.05
2
TRIzol 提取总RNA，逆转录成cDNA 后，采用聚
分娩孕周（周） 32.43 ± 3.1600 39.22 ± 0.4300 <0.01
合酶链反应进行目的基因的扩增。引物序列如下：
收缩压（mmHg） 171.83 ± 8.5800 117.00 ± 10.620 <0.01
MMP2：5′⁃GCTCAGATCCGTGGTGAGAT⁃3′（正向）， 舒张压（mmHg） 106.83 ± 4.2600 73.33 ± 5.7800 <0.01
5′⁃GGTGCTGGCTGAGTAGATCC⁃3′（反向）；TIMP1： 蛋白尿（mg/24 h）5 278.89 ± 342.71 54.70 ± 8.9900 <0.01
5′⁃ AATTCCGACCTCGTCATCAG⁃3′（正向），5′⁃GTT⁃ 出生体重（g） 1 665.00 ± 761.10 3 716.67 ± 484.42 <0.01
GTGGGACCTGTGGAAGT ⁃ 3′（反 向）；GAPDH：5′ ⁃ 1分钟Aparg评分 7.90 ± 1.0300 10.00 ± 0.0000 <0.01
GACTCATGACCACAGTCCATGC ⁃ 3′（正 向），5′ ⁃
AGAGGCAGGGATGATGTTCTG⁃3′（反向）。最终结 2.2 胎盘样本多肽组分的质谱分析

果以2 -ΔΔCt 计算。 通过LC⁃MS/MS 共鉴定了3 582个多肽片段，来
1.2.11 Western blot 源于499个蛋白。检测到的肽段分子量主要分布在
RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，BCA法测 1 000~1 800 Da（图 1A）；肽段等电点主要分布在
定蛋白浓度，随后上样进行 SDS⁃PAGE 电泳。然后 8.0~11.0（图1B）；结合分子量的因素来看，肽段的分
将分离后的蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶 布并不均匀，主要集中在等电点为10.0左右的区域
液封闭液封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜（抗MMP2一抗、 （图1C）。
抗TIMP1一抗、抗GAPDH一抗浓度均为1∶1 000），后 2.3 差异性多肽鉴定与筛选
室温孵育二抗 1 h（二抗浓度为 1∶5 000），洗膜后 利用统计学方法筛选差异多肽，差异多肽筛选
ECL 发光法显影。使用 Image J 对条带进行半定量 标准为 P < 0.05 且 Fold⁃change 值<0.83 或者>1.2，共
灰度分析。 筛选出48条差异多肽。其中18条多肽在子痫前期
1.3 统计学方法 中上调，30条多肽在子痫前期中下调（表2）。
采用SPSS 17.0和Graphpad prism8.0软件进行统 2.4 胎盘差异性多肽所匹配蛋白质的生物学分析
计分析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，组间比 2.4.1 GO功能分析
较采用t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。 通过在线数据库对差异多肽所对应的前体蛋
白质进行功能注释分析（图 2）。结果表明，这些前
2 结 果
体蛋白的功能类别主要涉及分子的结合，包括蛋白
2.1 胎盘样本临床数据统计 结合、DNA 与 RNA 结合、转录因子结合以及有机环
对纳入研究的孕妇年龄、体重指数（body mass 状化合物的结合，此外还涉及抗氧化以及分子载体
index，BMI）、孕周、收缩压、舒张压、蛋白尿、胎儿出 的功能。这些蛋白多数位于细胞质中，还有一部分
生体重、Aparg评分等临床信息进行统计（表1）。 位于细胞外以及细胞核中。所参与的生物学过程

A B C
15 20 2 500
（ 个 ） 10 （ 个 ） 15 （ Da ） 2 000

肽段 5 肽段 10 分子量 1 500
1 000
5
500
0 0 0
11.0~12.0
9.0~10.0
1 000~1 200
800~1 000
600~800 1 200~1 400 1 800~2 000 4.0~5.0 5.0~6.0 6.0~7.0 7.0~8.0 8.0~9.0 10.0~11.0 0 5 等电点 10 15
1 400~1 600
2 200~2 400
2 000~2 200
1 600~1 800
分子量（Da） 等电点
A：多肽相对分子量分布；B：多肽等电点分布；C：相对分子量与等电点的散点图。
图1 液相色谱⁃质谱鉴定的胎盘多肽性质分析
Figure 1 Characteristics of placental peptide identified by liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry（LC⁃MS/MS）