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第41卷第8期       邵慧静，王天俊，张嘉嘉，等. 子痫前期胎盘样本的多肽组学分析及差异多肽功能的初步探究［J］.
                  2021年8月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1151-1159                      ·1153 ·


                0.1%三氟乙酸，80%乙腈溶液，使液体缓慢流过除盐                        1.2.4 生物信息学和统计学分析
                柱，将多肽洗脱下来，使用新EP管收集洗脱溶液，洗                              利用在线工具（http：//web.expasy.org/compute）
                脱液冷冻干燥。                                           分析多肽的分子量和等电点分布情况。并利用GO
                1.2.2 LC⁃MS/MS分析                                 （http：//geneontology.org） 和 KEGG （http：//www.ge⁃
                    色谱条件：采用 NanoAcuity 超高压纳升级液相                   nome.jp/kegg）分别对差异肽段匹配的蛋白质进行功
                色谱系统进行分离。液相 A 液为 0.1%甲酸⁃水溶                        能富集分析和通路富集分析。
                液，B液为0.1%甲酸⁃乙腈溶液。样品以200 μL A相                     1.2.5 细胞培养及多肽处理

                溶解，由自动进样器吸取2 μL样品后，以10 μL/min                         HTR⁃8/SVneo 在含有 10% FBS 的 DMEM 中培
                流速传送到捕集柱上捕集 2 min。捕集柱上的样品                         养。HUVECs 在含有 10% FBS 的 ECM 培养基中培
                在分析柱上进行色谱分离，流速为 300 nL/min。 相                     养。两者均置于37 ℃、5% CO2的潮湿恒温培养箱中
                关液相梯度为 0~105 min，B 液线性梯度从 5% 到                    常规培养。多肽干粉用高压蒸馏水溶解至终浓度
                30%；105~110 min，B 液线性梯度从 30% 到 90%；               为 10 mmol/L 保存，使用前稀释至相应浓度。本实
                110~112 min，B 液维持在 90%；112~113 min，B 液线           验中，实验组用 50 μmol/L 浓度的多肽处理，对照组
                性梯度从90% 到5%；B液保持5% 7 min。样本间用                     加入等量的高压蒸馏水，随后两组同时置于 37 ℃、
                空白溶剂30 min流动相梯度清洗1次。                              5% CO2的潮湿恒温培养箱中继续培养 24 h 以待后
                    质谱条件：Q Exative HF 质谱仪离子源喷雾电                   续实验。
                压为2.0 kV，加热毛细管设定为300 ℃，采用数据依                      1.2.6 CCK⁃8法测定细胞增殖能力
                赖模式自动在 MS 和 MS/MS 间切换采集。全扫描                           多肽处理 HTR⁃8/SVneo 细胞 24 h 后，10%FBS
                MS 使用 Orbitrap 进行一级扫描，扫描范围为 m/z                   DMEM重悬细胞并将细胞接种到96孔板，每组设置
                350~1 600，分辨率设定为60 000（m/z 200处）。离子               5 个重复反应孔，每孔 2 000 个细胞。细胞培养 0、
                最大引入时间为 50 ms，自动增益控制（automatic                    24、48、72、96 h后分别加入10 μL CCK⁃8试剂，孵育
                gain control，AGC）设定为 3×10 ，随后使用高能碰撞               2 h后在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光
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                解离（higher energy C⁃trap dissociation，HCD）对 符      度。实验独立重复3次。
                合串级（MS/MS）碎裂条件的强度前 10 名母离子                        1.2.7 克隆形成实验
                进行碎裂并用 orbitrap 进行扫描，扫描分辨率设定                          多肽处理 HTR⁃8/SVneo 细胞 24 h 后，10%FBS
                为 15 000。扫描范围根据母离子质荷比自动控制，                        DMEM 重悬细胞。随后将细胞接种到 6 孔板中，每
                最低扫描范围固定为m/z=100处，最高到2 000。进                      组 设 置 3 个 重 复 孔 ，每 孔 600 个 细 胞 ，10% FBS
                行MS/MS的最低离子强度值设定为50 000。MS/MS                     DMEM 完全培养基继续培养 10 d。10 d 后，PBS 洗
                时离子最大引入时间为 100 ms，AGC 控制设定为                       涤细胞3次，甲醇固定，0.1%结晶紫染色。随后在倒
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                2.0×10 ，母离子选择窗口设定为 2 Da。对于 2、3、4                  置显微镜下随机取3个视野进行克隆计数。实验独
                电荷数的离子进行MS/MS采集，动态排除设定为每                          立重复3次。
                个母离子在 10 s 内进行 1 次 MS/MS，之后排除 30 s，               1.2.8 Transwell实验
                30%的碰撞能量。                                             多肽处理 HTR⁃8/SVneo 细胞 24 h 后，用无血清
                1.2.3 质谱数据检索分析                                    培养基重悬细胞，随后将细胞加入 Transwell 小室，
                    Q Exative HF 质谱仪所采集的质谱数据利用                    每组3个重复实验孔，每孔3×10 个细胞。下室加入
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                MaxQuant（Version 1.6.5.0）进行搜索，检索数据库为              10%FBS DMEM 培养基，放入孵箱继续培养 24~
                SwissProt数据库（种属：Homo sapiens，包含20 422条            48 h。终止培养后，棉签擦去上室未穿膜细胞，甲醇
                reviewed序列）。检索参数设置为：甲硫氨酸残基和                       固定，0.1%结晶紫染色。倒置显微镜 100 倍视野下
                天冬酰胺残基为可变修饰；无酶切；一级质谱精度                            随机取 5 个视野对穿膜细胞进行统计，并取平均值
               （4.5 ppm）；二级质谱精度（20 ppm）。多肽筛选门槛                    进行分析。实验独立重复3次。
                设定如下：假阳性率（false discovery rate，FDR）小于             1.2.9 HUVECs细胞成管实验
                1%；蛋白最少匹配1条独有肽段（unique peptides）；肽                    多肽处理HUVECs细胞24 h后，10%FBS ECM培
                段最少包含7个氨基酸。多肽定量采用MaxQuant软                        养基重悬细胞。将基质胶提前置于4 ℃融化，96孔板
                件（version 1.6.5.0）及iBAQ算法，FDR设置为0.01。             中每孔铺胶 50 μL 后放至 37 ℃培养箱孵育 40 min
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