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第41卷第9期      刘 萍，周     宏，伍雪橙，等. 法舒地尔二氯乙酸盐对低氧性肺动脉高压大鼠的治疗作用及机制［J］.
                  2021年9月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1281-1288                      ·1283 ·


                总缺氧时间为28 d。                                       1.2.6  Western blot 检测肺组织中 ROCK1、ROCK2
                1.2.2 右心导管检查及右心室肥厚程度测定                            表达水平
                    所有大鼠称重后予以2%戊巴比妥钠溶液（60mg/kg）                       称取 30 mg 大鼠肺组织，加入含蛋白酶抑制剂
                腹腔注射麻醉。将麻醉后大鼠仰卧固定于动物操                             的 RIPA 裂解液，剪碎、匀浆，提取肺组织总蛋白。
                作台上，分离右颈总静脉并做一“V”型切口，插入充                          BCA 法测定蛋白含量。蛋白经电泳分离后转移至
                盈肝素钠溶液的聚乙烯导管。导管弯头端经上腔                             PVDF 膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h，加入抗
                静脉、右心房至右心室，另一端连接压力换能器，应                           ROCK1、ROCK2抗体（稀释比例1∶1 000），4 ℃孵育过
                用 Powerlab 生物信号采集系统测定右心室收缩压                       夜。TBST洗涤3次后加入二抗（稀释比例1∶5 000），
               （right ventricular systolic pressure，RVSP）。RVSP 测  室温孵育1 h。TBST 洗涤3次后加入ECL 化学发光
                定结束后处死大鼠，收集大鼠心脏。沿室间隔边缘                            液，置于化学发光仪中合适条件下曝光并保存图
                游离出右心室（right ventricle，RV）及左心室+室间隔                像，结果用Image Lab软件进行分析。
               （left ventricle+septum，LV+S）。滤纸吸干水分后分              1.3  统计学方法
                别称量 RV 和 LV+S 的重量，计算 RV/（LV+S）比值，                     采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学处理，所

                即为右心室肥厚指数（right ventricular hypertrophy           有数据以均数±标准差（x ± s）表示。多组样本间数
                index，RVHI）。                                      据分析采用单因素方差分析，组间比较使用 LSD⁃t
                1.2.3 肺小动脉形态学分析                                   检验法。P < 0.05为差异有统计学意义。
                    分离左肺上叶，在 4%多聚甲醛中固定 24 h，石
                                                                  2  结 果
                蜡包埋后制成 5 μm 厚度切片并进行苏木素⁃伊红
               （hematoxylin⁃eosin，HE）染色、α⁃SMA 免疫组织化学              2.1  FDCA对HPH大鼠RVSP和RVHI的影响
                染色及Masson染色，于光学显微镜下观察肺小动脉                             血流动力学结果显示：与 CON 组相比，CH 组
                病理变化。每张切片随机拍摄至少 20 张直径 30~                        RVSP显著升高，FDCA治疗后RVSP显著降低，差异
                100 μm 肺小动脉，计算肺小动脉中膜层肥厚程度                         有统计学意义（P < 0.01）；CON+FDCA 组与 CON 组
               （pulmonary artery medial thickness，PAMT）=（血管外      相 比 ，差 异 没 有 统 计 学 意 义（P > 0.05，图 1A）。
                径-血管内径）/血管外径×100%。根据肺小动脉α⁃                        RVHI结果显示：与CON组相比，CH组RVHI显著增
                SMA阳性表达部分占血管周径的比例，将肺小动脉                           加，差异有统计学意义（P < 0.01），CH+FDCA 组较
                分为非肌化（<25%）、部分肌化（25%~75%）和完全                      CH 组 RVHI 显著降低（P < 0.01），与 CON 组相比差
                肌化（>75%）3种类型，分别统计各类型血管所占百                         异无统计学意义（P > 0.05）。CON+FDCA 组与CON
                分比。使用Image Pro Plus 6.0软件统计Masson染色               组相比，差异无统计学意义（P > 0.05，图1B）。
                图片中蓝色区域胶原蛋白沉积面积与总面积的比                             2.2 FDCA对HPH大鼠右心室心肌细胞肥大的影响
                值，评估肺小动脉外膜纤维化程度。                                      HE 染色结果显示：CON 组与 CON+FDCA 组右
                1.2.4 右心室形态学分析                                    心室心肌细胞结构正常，CSA 较小；CH 组右心室心
                    分离右心室组织，在 4%多聚甲醛中固定 24 h，                     肌细胞肥大；CH+FDCA 组心肌细胞较 CH 组变小
                石蜡包埋后制成 5 μm 厚度切片并进行 HE 染色。                      （图 2A）。右心室 CSA 统计结果显示：与 CON 组及
                在光学显微镜下观察右心室心肌细胞病理变化。                             CON+FDCA 组相比，CH 组右心室心肌细胞 CSA 显
                使用 Image J 软件统计右心室心肌细胞横截面积                        著增加；CH+FDCA组右心室心肌细胞CSA较CH组
               （cross⁃sectional area，CSA）。                        显著降低，差异有统计学意义（P < 0.01，图2B）。

                1.2.5  ELISA法检测肺组织中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α以              2.3  FDCA 对 HPH 大鼠肺小动脉中膜肥厚及炎症
                及MLCK、MLCP水平                                      浸润的影响
                    称取 100 mg 肺组织，剪碎加入 1 mL PBS，匀浆                    HE 染色结果显示：CON 组与 CON+FDCA 组肺
                后3次冻融使细胞破坏释放出细胞内成分，4 ℃离心                          小动脉结构正常，血管壁薄，血管周围无明显炎症

                机，3 000 r/min 离心 20 min，收集上清。按照 ELISA             细胞浸润；CH组肺小动脉中膜层增厚，血管周围有
                试剂盒说明书进行分析。肺组织中 IL⁃1β、IL⁃6、                       大量炎症细胞浸润；CH+FDCA组肺小动脉中膜层较
                TNF⁃α含量最终以pg/mL计算，MLCK、MLCP水平最                    CH 组变薄，炎症细胞浸润程度较 CH 组减轻（图
                终以U/L计算。                                          3A）。PAMT统计结果显示：与CON组及CON+FDCA
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