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第41卷第9期      张 翔，王子杰，郑 明，等. M1型巨噬细胞极化在内皮细胞转分化及慢性移植肾失功中的作用［J］.
                  2021年9月                  南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1296-1303，1309                   ·1299 ·


                胞方向极化。通过PCR、细胞免疫荧光及流式细胞学                          激产生的反应、对病毒感染的反应、体液免疫反
                验证其极化效率。共培养方法同前，以上实验均重复                           应、细胞外结构的重建等过程（图 1B、C）；而基于
                3次。                                               KEGG 数据库的通路富集分析表明，差异表达基因
                1.2.5 聚合酶链式反应（PCR）                                主要富集于免疫排斥及移植物抗宿主疾病、类风
                    所有样本的 RNA 通过 HiScript Ⅱ合成 cDNA，               湿性关节炎、1 型糖尿病等过程（图 1D、E）。使用
                qRT⁃PCR 则是在 AB7300 实时荧光定量仪（Applied                Cibersort 软件对各个样本的免疫细胞成分构成进
                Biosystems 公司，美国）上进行，同时利用 AA341 实                 行拟合，绘制了移植肾的免疫细胞构成的柱状图
                时定量 PCR 试剂行 PCR 反应，GADPH 作为内参照                   （图 1F），并通过小提琴图发现 CAD 组的患者移植
                检测 mRNA 的表达量。每个样本重复 3 次，通过比                       肾中存在显著的单核细胞和巨噬细胞浸润（P＜
                较Ct值进行数据分析。                                       0.05，图 1G）。
                1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot，WB）                         接着在本中心的 CAD 组患者移植肾组织中进
                    样本使用 RIPA 试剂裂解抽提出蛋白质后，经                       行验证。HE染色显示CAD组患者移植肾中出现显
                测定浓度，用10% SDS⁃PAGE分离蛋白，并转移到聚                      著的肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化（图
                偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封闭后，将条带置于一抗                         2A）；Masson 染色提示移植肾间质出现大量胶原纤
               （Vimentin，1∶10 000；Collagen I，1∶1 000；GADPH，       维蛋白沉积（图 2B、C）。组织免疫荧光实验也发现
                1∶5 000；VE⁃Cadherin，1∶1 000；α⁃SMA，1∶20 000）       CD68（+）iNOS（+）的 M1 型巨噬细胞于 CAD 组肾组
                中，4 ℃孵育过夜；TBST冲洗3次，每次15 min；再分                    织中浸润明显增加（P＜0.05，图2D、E）。此外，CAD
                别于与二抗（HRP 标记的抗鼠 IgG，1∶5 000；HRP 标                 组中巨噬细胞的特异性指标 CD68 mRNA 的表达量
                记的抗兔 IgG，1∶5 000）孵育；PBST 冲洗 3 次，每次                也显著高于对照组，而 CAD 组中 M1 型巨噬细胞的
                15 min；化学发光系统（Bio⁃Rad 公司，美国）检测信                   特异性指标 iNOS mRNA 表达量也显著高于对照组
                号，并使用Image Lab软件进行分析。实验重复3次。                     （图2F）。上述结果提示，非特异性免疫应答参与了
                1.3  统计学方法                                        CAD 的发生过程，且 M1 型巨噬细胞可能在 CAD 发
                    所有数据均利用R 3.6.1进行数据分析，用Lim⁃                    生过程中发挥重要作用。
                ma 包对公共转录组数据进行差异分析，使用 Clus⁃                       2.2  体外诱导Raw264.7细胞向M1、M2巨噬细胞诱
                terprofiler 包分别基于 GO（Gene Ontology）和 KEGG         导分化
               （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库           使用 5 ng/mL LPS、40 ng/mL IFN⁃γ诱导巨噬细
                行基因富集分析。同时借助生物信息学软件Ciber⁃                         胞系 Raw264.7，作用 24 h 使它向 M1 型巨噬细胞极
                sort（cibersortx.stanford.edu）对各个样本的免疫细胞           化。使用40 ng/mL IL⁃4诱导巨噬细胞系Raw264.7，
                浸润状态进行拟合（拟合次数=100次）。利用Image                       作用24 h使它向M2型巨噬细胞极化。细胞免疫荧
                J软件进行免疫荧光强度及免疫组化阳性区域的计                            光染色发现刺激 24 h 后 M1 型 Raw264.7 均为 F4/80
                算。所有统计图的绘制与统计均借助 Graphpad 软                      （+）iNOS（+）细胞，而 M2 型 Raw264.7 均为 F4/80（+）
                件（7.0.1）。使用 Student’s t 方法比较两组间差异，                CD206（+）细胞（图3A、B）。接着使用流式细胞学的
                多组间计量资料比较使用方差分析，还用Tukey’s多                        方法，用iNOS与CD206标记Raw264.7，发现刺激24 h
                重比较检验方法比较两组之间的差异。P＜0.05为差                         后 Raw264.7 向 M1 极化的阳性率为 93.3%，M2 极化
                异有统计学意义。                                          的阳性率为83.0%（图3C~E）。PCR检测发现M1型
                                                                  巨噬细胞的标志物（CD86、iNOS）在向 M1 极化的
                2  结 果
                                                                  Raw264.7 中表达增高，M2 型巨噬细胞的标志物
                2.1  CAD 患者移植肾中存在显著的单核巨噬细胞                       （ARG1、CD206）在向 M2 极化的 Raw264.7 中表达增
                浸润                                                高（图3F）。
                    首先，下载 GSE21374 数据集，对其进行均一化                    2.3 M1型巨噬细胞极化诱导内皮细胞的EndMT
                处理，并对移植肾功能稳定患者与CAD患者的转录                               体外诱导巨噬细胞向M1型极化，并将M1型巨
                组信息进行差异分析，发现存在大量的差异基因                             噬细胞与内皮细胞联合培养。结果表明，随着培养
               （图 1A）。基于 GO 数据库的通路富集分析结果提                         时间的延长，内皮细胞的形态由铺路石样变成梭形
                示，差异表达的基因主要富集于对 LPS 和 IFN⁃γ刺                     （图4A），而细胞免疫荧光结果提示共培养后内皮细
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