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第41卷第9期
               ·1298 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年9月


                                                 表1 纳入研究的患者的一般信息
                                     Table 1 Baseline characteristics of patients included in this study
                           临床变量                       CAD组（n=20）             对照组（n=20）               P值
                   年龄（岁，x ± s）                          40.3 ± 11.0           56.4 ± 11.7            0.056
                   男性（例）                                   12                    13                  0.744
                   BMI（kg/m ，x ± s）                    020.0 ± 5.400          23.8 ± 3.20            0.011
                           2
                   移植物存活时间（年，x ± s）                     08.4 ± 4.80              —
                   初次/二次移植（n/n）                           20/0                   —
                   免疫抑制方案（例）
                     强的松+霉酚酸类+他克莫司                         14                    —
                     强的松+霉酚酸类+环孢素                          06                    —
                   糖尿病（例）                                  08                    03                  0.077
                   高血压（例）                                  02                    09                  0.013
                   血清肌酐（μmol/L，x ± s）                  535.6 ± 312.7          93.2 ± 18.8          ＜0.001
                   血清尿素氮（μmol/L，x ± s）                  24.6 ± 10.1            6.7 ± 1.7           ＜0.001



              抗体（130⁃116⁃421，Miltenyibiotec 公司，德国）；脂多           1.2.3 HE染色与Masson染色

              糖（lipopolysaccharide，LPS）（00 ⁃ 4976 ⁃ 93，Thermo        HE 染色玻片脱蜡复水方法同免疫荧光，将组
              Fisher Scentific 公司，美国）、干扰素⁃γ（interferon⁃γ，       织玻片置入苏木素液中染色5 min，清水冲洗5 min；
              IFN⁃γ）（CM41，吴江近案蛋白质科技有限公司）；引                      1%盐酸乙醇酸化30 s，清水冲洗30 s；伊红液3 min，
              物由南京擎科生物科技有限公司设计合成。                               清水冲洗5 min；75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水
              1.2  方法                                           乙醇脱水，并置入二甲苯，最后用中性树脂封片。
              1.2.1 生信分析数据的获取                                   Masson染色的玻片脱蜡、复水、苏木素染色、酸化同
                  本 研 究 所 使 用 的 GSE21374 数 据 集 从 GEO            HE 染色；接着用 Masson 丽春红酸性复红液处理 5~
             （Gene Expression Omnibus）公共数据库（www.ncbi.           10 min；2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷钼酸水溶
              nlm.nih.gov/gds）获得。包含了术后早期的穿刺移植                   液分化 3~5 min 后直接用苯胺蓝染 5 min；0.2%冰醋
              肾标本的转录组信息，同时也包含了移植肾的存活                            酸水溶液浸洗片刻；脱水封片同HE染色。
              时间与存活状态。                                          1.2.4  M1、M2 型巨噬细胞的诱导极化及细胞联合
              1.2.2 免疫荧光染色                                      培养
                  石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，然后用无水乙                                使 用 5 ng/mL LPS 和 40 ng/mL IFN ⁃ γ 诱 导
              醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇梯度复水后，将玻                       Raw264.7 细胞，作用时间为 24 h，使细胞向 M1 型巨
              片置入浓度为0.01 mol/L、pH 6.0且已沸腾的柠檬酸                   噬细胞方向极化。通过 PCR、细胞免疫荧光及流式
              钠溶液中15 min，后缓慢降温至室温。接着加入3%                        细胞学验证其极化效率。将2 mL极化的M1型巨噬
              H2O2，室温孵育 15 min 后使用 TBST 洗 3 次，每次                细胞按 1×10 个/mL 置于 0.4 μm 的 Transwell 小室上
                                                                            5
              5 min。洗完后使用免疫荧光封闭液封闭。封闭完                          层，而小鼠主动脉内皮细胞则种植与小室下层，细
              后使用一抗（CD68 抗体稀释 1∶800，iNOS 抗体稀释                   胞接种密度为 1×10 个/孔，细胞共培养条件为
                                                                                    5
              1∶1 000，CD206抗体稀释1∶200）于4 ℃冰箱孵育过                  DMEM+10%FBS。联合培养 72 h 后，提取下层内皮

              夜；TBST 洗 3 次，每次 5 min；接着使用 Alexa Fluor       ®    细胞的总蛋白及RNA待用。
              488 标记的驴抗小鼠二抗、Alexa Fluor 555 标记的                      小鼠主动脉内皮细胞则种植于小室下层，分别
                                                ®
              驴抗兔二抗混合室温孵育组织1 h；TBST 洗3次，每                       在0、24、48 h后向6孔板孔中加入种植了极化的M1
              次 5 min；使用 DAPI 孵育组织 15 min；TBST 洗 3 次，           型巨噬细胞的 Transwell 小室，进而获取 M1 型巨噬
              每次 5 min；接着使用抗荧光淬灭剂滴上组织，使用                        细胞作用0、24、48、72 h的内皮细胞。

              盖玻片封片，在荧光显微镜下观察。Alexa Fluor                  ®         选取 RAW264.7 巨噬细胞系，使用 40 ng/mL 白
              488 标记蛋白在荧光镜下为绿色，而 Alexa Fluor               ®    细 胞 介 素（interleukin，IL）⁃ 4 诱 导 巨 噬 细 胞 系
              555标记蛋白在荧光镜下为红色。                                  Raw264.7，作用时间为24 h，使细胞向M2型 巨噬细
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