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第41卷第9期      张 翔，王子杰，郑 明，等. M1型巨噬细胞极化在内皮细胞转分化及慢性移植肾失功中的作用［J］.
                  2021年9月                  南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1296-1303，1309                   ·1297 ·


                kidney tissues（P < 0.05）. Co⁃cultured with M1 macrophages，the EndMT of endothelial cells was promoted. Conclusion：We have
                observed significant M1 macrophages infiltration in the allograft tissues diagnosed with CAD，which may induce the occurrence of
                EndMT and CAD progression in renal transplant recipients.
               ［Key words］ macrophage polarization；endothelial⁃to⁃mesenchymal transition；chronic allograft dysfunction；kidney transplantation
                                                                        ［J Nanjing Med Univ，2021，41（09）：1296⁃1303，1309］




                    人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）           稳定的20例移植供肾的穿刺标本；而20例CAD的移
                配型和新型免疫抑制剂的出现极大降低了肾移                              植肾组织（CAD 组）均来自于 2019 年 1 月—2020 年
                植术后急性排斥反应的发生，但是慢性移植肾失                             7 月于南京医科大学第一附属医院随访的移植肾功
                功（chronic allograft dysfunction，CAD）仍然是影响         能不全患者。
                移植物存活的主要并发症之一，慢性移植肾间质                                 移植肾功能不全患者的纳入标准：①血清肌酐
                纤维化形成是 CAD 的主要病理改变                ［1］ 。内皮细        缓慢升高，病程中无明显急性排斥反应症状，血清

                胞向间充质细胞转分化（endothelial⁃to⁃mesenchymal             肌酐大于 200 μmol/L；②移植肾功能不全且药物干
                transition，EndMT），是内皮细胞在各种外部刺激下                   预治疗无效；③病程中无明显感染症状。
                丢失内皮细胞的特征，转变成肌成纤维细胞，分                                 CAD移植肾的穿刺标本的获取方式：CAD患者
                泌大量细胞外基质，进而促进了病变组织的纤维                             为行二次异体肾移植术而行失功移植肾切除捐献的
                化进程 。既往研究发现内皮细胞是肌成纤维细                             病理组织标本，或因为肌酐升高及移植肾病变而行
                      ［2］
                胞的重要来源之一，且肾微血管 EndMT 过程在慢                         CAD肾穿刺而获取的标本。对照组和CAD患者的临
                性移植肾间质纤维化形成及 CAD 中发挥了重要                           床资料见表1。肾脏标本使用多聚甲醛固定，包埋后
                    ［3］
                作用 。                                              切片行染色实验。部分组织则以RNAkeeper（R501⁃
                    目前认为，巨噬细胞可在不同刺激条件下极化                          01，南京诺唯赞公司）于-80 ℃保存。
                成两种不同的巨噬细胞表型，一种称为经典活化M1                               肾功能正常移植肾患者及 CAD 患者术前的群
                型巨噬细胞，另一种称为替代突进活化 M2 型巨噬                          体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）均为阴
                细胞 。研究表明巨噬细胞极化可能参与介导了慢                            性。肾功能正常患者的移植肾组织及 CAD 患者肾
                    ［4］
                               ［5］
                性移植肾的损伤 。而另一项研究发现 3 个 M1 型                        组织标本的收集均通过南京医科大学第一附属医
                巨噬细胞特异性基因（CXCL11、CCL19 和 CD86）可                   院伦理委员会批准，本研究所遵循的方案为 2016⁃
                预测移植肾损伤的预后 。此外，在大鼠肾移植慢                            SR⁃029，并且获得了所有移植受者的书面知情同
                                     ［6］
                性排斥模型中，巨噬细胞极化过程分泌的细胞因子                            意。在研究中执行的所有程序都符合国家研究委
                白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）、单核细胞趋化蛋白⁃1              员会的道德标准，并符合1964年赫尔辛基宣言及其
               （monocyte chemoattractant protein⁃1，MCP⁃1）及诱导型     后来修订的道德标准。
                一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）      1.1.2 细胞与试剂
                也被发现参与了CAD的发生，并导致了慢性移植肾                               小鼠来源的巨噬细胞Raw264.7购自上海源之信
                    ［7］
                损伤 。然而，巨噬细胞极化在EndMT及CAD中的                         生物技术有限公司；CD68抗体（ab125212）、诱导型一
                作用尚不明确。因此，本研究拟结合生物信息学分                            氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）
                析，在组织和细胞水平探讨 M1 型巨噬细胞极化在                          抗体（ab210823）、CD31 抗体（ab24590）、α⁃SMA 抗
                EndMT过程及CAD中发挥的作用。                                体（ab124964）、Collagen Ⅰ 抗 体（ab260043）、VE⁃
                                                                  cadherin 抗 体（ab33168）、GADPH 抗 体（ab9485）、
                1  材料和方法
                                                                  Alexa Fluor 488 标记的驴抗小鼠二抗（ab150109）、
                                                                            ®
                                                                            ®
                1.1  材料                                           Alexa Fluor 555 标 记 的 驴 抗 兔 二 抗（ab150062）
                1.1.1 移植肾脏组织的获取                                  （Abcam 公司，美国）；Vimentin 抗体（10366⁃1⁃AP）、
                    所有移植肾功能正常的肾脏组织（对照组）来                          F4/80 抗体（28463⁃1⁃AP）、CD206 抗体（60143⁃1⁃Ig）
                源于2019年1月—2020年1月于南京医科大学第一                       （Proteintech公司，美国），CD206流式抗体（17⁃2061⁃
                附属医院行同种异体肾移植术且术后移植肾功能                             80，Thermo Fisher Scentific  公司，美国），iNOS 流式
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