Page 58 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第9期
·1324 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年9月

山羊血清封闭 30 min；4 ℃孵育一抗过夜；PBST 洗 A 3.0 *
涤 3 次，每次3 min；37 ℃孵育荧光二抗1 h；PBST洗 2.5 **
涤3次，每次3 min；DAPI染色5 min；PBST洗涤4次，
每次5 min。图像使用激光共焦显微镜拍摄。 2.0
1.2.5 细胞周期分布的检测 WNT7b mRNA相对表达水平 1.5
细胞转染 48 h 后用不含 EDTA 的胰酶消化，收 1.0
集各组细胞后-20 ℃固定于无水乙醇中。检测当天 0.5

将固定细胞离心弃去乙醇，加入3 mL室温下的PBS 0
A875 A375 SK⁃MEL⁃28
放置 15 min 使细胞再次水化，离心弃上清，加入 B
A875 A375 SK⁃MEL⁃28
1 mL DNA staining solution 涡旋振荡 5 s 混匀，室温 WNT7b -39 kDa
避光孵育 30 min 后使用流式细胞分析仪检测细胞
GAPDH -36 kDa
周期分布。
A：各组WNT7b mRNA 相对表达量；B：各组WNT7b蛋白相对表
1.2.6 细胞划痕实验
达量。两组比较，P < 0.01，P < 0.001（n=3）。
**
*
将 A375 细胞铺于 6 孔板中，转染 48 h，待细胞 图1 不同黑素瘤细胞系中WNT7b的表达水平
贴壁生长至 80%时，用 10 μL 无菌移液枪头沿孔中 Figure 1 Expression levels of WNT7b in melanoma cell
间轻轻划过，然后用 PBS 洗涤细胞 2 次去除漂浮细 lines
胞，分别于0、48 h拍照，观察划痕愈合情况。
1.2.7 Transwell实验 2.3 WNT7b敲低对A375细胞生长周期的影响
制备细胞悬液前先让细胞撤血清饥饿6 h，进一 流式细胞分析检测细胞周期，结果显示，与 NC
步去除血清的影响，消化后离心弃去培养液，用 组相比，WNT76⁃siRNA组 G1 期细胞数量增加，说明
PBS 洗 1~2 遍，用无血清培养基重悬。取细胞悬液 敲低 WNT7b 后，A375 细胞生长阻滞于 G1 期，差异
100 μL（1×10 个细胞）加入 Transwell 小室；24 孔板 有统计学意义（P < 0.01，图3）。
5
下室加入 500 μL 含 30%FBS 的培养基，常规培养 2.4 WNT7b敲低对A375细胞迁移、侵袭能力的影响
12 h。吸除小室培养基，4%多聚甲醛固定，用湿棉 划痕实验结果显示WNT7b敲低后A375细胞迁
球擦去上表面细胞，0.1%结晶紫染色15 min，PBS洗 移能力受到抑制，差异有统计学意义（P < 0.01，图
掉多余染色，用镊子取下小室底膜，封片观察。 4A）；Transwell实验结果显示WNT7b敲低后A375细
1.3 统计学方法 胞侵袭性明显降低，差异有统计学意义（P < 0.001，
使用 GraphPad Prism 5.0 分析从 3 个独立实验 A 1.2 *
WNT7b mRNA相对表达水平 0.6
中获得的数据，并以平均值±标准差（x ± s）表示，多 1.0 *
组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK值，P < 0.8
0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 0.4

2.1 WNT7b在不同黑素瘤细胞中的表达情况 0.2
qRT⁃PCR 及 Western blot 结果显示，WNT7b 在 0 空白对照组 NC组 WNT7b⁃siRNA组
人源黑素瘤细胞 A375、SK⁃MEL⁃28、A875 中均有表 B 空白对照组 NC组 WNT7b⁃siRNA组
达，A375较其他细胞系WNT7b表达量更高，差异有 WNT7b -39 kDa
统计学意义（P < 0.01，图1）。
GAPDH -36 kDa
2.2 siRNA瞬时转染A375细胞WNT7b敲低效率检测
A：各组WNT7b mRNA 相对表达量；B：各组WNT7b蛋白相对表
选取WNT7b表达量高的A375细胞系进行siRNA
达量。两组比较，P < 0.001（n=3）。
*
瞬时转染，qRT⁃PCR 及 Western blot 结果显示与 NC
图 2 A375 细胞中 WNT7b 在 mRNA 与蛋白水平敲低效率
组相比，WNT7b⁃siRNA 转染组 A375 细胞中 WNT7b 的检测
ｍRNA 及蛋白表达量均明显降低，敲低效率达 Figure 2 Knockdown efficiency detection of WNT7b
60%，差异有统计学意义（P < 0.001，图2）。 mRNA and protein in A375 cells