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第41卷第9期           陈奕鹤，马立文，殷旭峰，等. WNT7b促进黑素瘤细胞的迁移、侵袭与上皮间质转化［J］.
                  2021年9月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1322-1328                      ·1323 ·


                加，并呈现出年轻化趋势，尽管它的发病只占皮肤                            镜（Olympus 公司，日本），实时定量 PCR 仪（ABI 公
                                              ［1］
                肿瘤的 4%，但死亡人数却占 75% 。WNT 信号通                       司，美国），流式细胞分析仪（Becton⁃Dickinson公司，
                路在胚胎发育、组织内稳态和再生中起着重要作                             美国）。
                  ［2］
                用 ，其功能异常与许多疾病的发生有关，包括胚胎                           1.2  方法
                畸形、退行性疾病和肿瘤发生              ［3- 4］ 。WNT 信号通路       1.2.1 细胞培养与转染
                被分为两种主要途径，包括β⁃catenin 依赖性途径                           A375、SK⁃MEL⁃28、A875 细胞系由中国医学科
                和β⁃catenin非依赖性途径，前者被称为经典途径或                       学院皮肤病研究所病理实验室赠送；A375、A875 细
                                                           ［5］
                WNT/β⁃catenin途径，而后者被称为非经典途径 。                     胞使用含有 1%双抗、10%胎牛血清的 DMEM 培养
                人类WNT家族由19 种不同的富含半胱氨酸的糖蛋                          基，SK⁃MEL⁃28 细胞使用含有 1%双抗、10%胎牛血
                白组成，一般来说 WNT1、WNT2、WNT3、WNT3a、                    清的MEM培养基，培养于37 ℃、5%CO2培养箱。实
                WNT8a、WNT8b、WNT10a和WNT10b是经典途径的                   验分为空载组（NC组）与实验组（WNT76⁃siRNA组），
                激活剂，而 WNT4、WNT5a、WNT5B、WNT6、WNT7a、                转染前24 h消化收集细胞并计数，按1×10 个/孔铺于
                                                                                                       5
                WNT7b 和 Wnt11 是非经典 WNT 信号的常见激活                    6孔培养板中，当细胞覆盖率达70%时进行转染（依
                剂，但也有研究表明，经典和非经典 WNT 通路之间                         照riboFECTTM CP reagent说明书），培养48 h后提取
                可能存在串扰 。报道证实 WNT7b 在前列腺癌中                         总RNA与总蛋白。敲低WNT7b的siRNA序列为5′⁃
                             ［6］
                      ［7］
                高表达 ，在高分化乳腺癌中的表达也明显高于低                            CAGACCTGGTGTACATTGA⁃3′。
                分化乳腺癌，且其高表达可作为判断乳腺癌预后的                            1.2.2 RNA提取与qRT⁃PCR
                标志 ；WNT7b还可以作为胰腺导管腺癌发生发展                              用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA 并进行浓度测
                    ［8］
                中 Wnt/β⁃catenin 信号通路差异激活的主要决定因                    定，RNA 反转录为 cDNA 后，使用 SYBR Green Mas⁃
                 ［9］
                子 ；miR⁃505通过直接靶向抑制WNT7b而使Wnt/β                    ter Mix 的RT⁃PCR扩增cDNA并检测，最后根据PCR
                ⁃catenin信号通路失活     ［10］ 。然而WNT7b在黑素瘤中             反应曲线记录的Ct值计算2           -ΔΔCt 值。引物设计见表1。
                还未有深入研究。本研究探讨了 WNT7b 在黑素瘤
                细胞中的表达情况，以及敲低WNT7b对人源黑素瘤                                       表1 qRT⁃PCR引物序列
                                                                         Table 1  Seguences of qRT⁃PCR primers
                细胞系A375分子生物学行为的影响，进而初步探讨
                                                                      基因                 序列（5′→ 3′）
                WNT7b在黑素瘤发生发展中的作用，为黑素瘤的靶
                                                                     WNT7b     上游：CACAGAAACTTTCGCAAGTGG
                向治疗提供新的线索。
                                                                               下游：GTACTGGCACTCGTTGATGC
                1  材料和方法                                             GAPDH     上游：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
                                                                               下游：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
                1.1  材料
                    DMEM 培养基、MEM 培养基（Gibco 公司，美                   1.2.3 Western blot检测
                国），胎牛血清（杭州四季清公司），胰蛋白酶⁃EDTA                            使用含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取细
                消化液、双抗、RIPA 蛋白裂解液、BCA 试剂盒（上海                      胞总蛋白，使用BCA蛋白分析试剂盒测量蛋白浓度
                碧云天公司），细胞周期检测试剂盒（上海联科生                            后加适量上样缓冲液 100 ℃煮沸 5 min 使其变性。
                物），siRNA、riboFECTTM CP reagent（广州锐博生              每孔取蛋白提取物20 μg通过SDS凝胶电泳分离并转

                物），TRIzol（Invitrogen 公 司 ，美 国），SYBR Green         移到PVDF膜上。用含有5%脱脂奶粉溶液的TBS⁃T
                Master Mix（Applied Biosystems 公司，美国）；WNT7b        封闭 1 h；4 ℃孵育一抗过夜；TBS⁃T 洗膜 3 次，每次
                抗体（Abcam公司，美国），GAPDH、Vimentin、E⁃cad⁃              10 min；室温下孵育相应二抗 1 h；TBS⁃T 洗膜 3 次，
                herin、N⁃cadherin 抗体（Cell Signaling Technology 公   每次10 min；然后使用ECL化学发光液在Bio⁃Rad分
                司 ，美 国），Cyclin E1、Cyclin D1、c ⁃ MYC、Snail1、       子成像仪上成像，并用Image J软件进行灰度分析。
                FOXC2 、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，         1.2.4 免疫荧光分析
                MMP）⁃2、MMP⁃3、MMP⁃7 抗体（Proteintech 公司，美                细胞计数后铺于共聚焦小皿中，转染 48 h 后；
                国），MMP⁃9抗体（Affbiotech公司，美国），羊抗鼠、羊                 PBS洗膜3次，每次10 min；4%多聚甲醛固定20 min；

                                                                  PBS 洗涤 3 次，每次 3 min；然后在室温下用 0.5%
                抗兔二抗（Cell Signaling Technology公司，美国）；CO2
                培养箱（Thermo Fisher公司，美国），激光共聚焦显微                   Tritonx⁃100 渗透 20 min；PBS 洗涤 3 次，每次 3 min；
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