Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第9期
·1274 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年9月

translocation of NF⁃ κB（p65）were detected by immunofluorescence assay. The protein levels of α ⁃SMA，collagen Ⅰ ，vimentin，
phospho⁃Smad3 and Smad3，phospho⁃p65 and p65 were determined by Western blot. Results：CDDO⁃Me treatment（62.5，125.0，

250.0，500.0 nmol/L）decreased hypoxia ⁃ induced elevations of cell viability in a concentration dependent manner，which showed
significant inhibition at concentration of 250.0 nmol/L and 500.0 nmol/L. CDDO⁃Me（500.0 nmol/L）remarkably inhibited hypoxia⁃
induced migration and myofibroblast transformation of PAAF，which reflected in improvement of hypertrophy，decreases in expressions
of α⁃SMA，collagenI and vimentin. In addition，CDDO⁃Me（500.0 nmol/L）significantly inhibited hypoxia⁃induced increased levels of
ROS and MDA，decreased levels of GSH and SOD，and improved the ability of antioxidation. Hypoxia increased the secretion of TGF⁃β
1 and activate TGF⁃β1/Smad3 signaling pathway in PAAF，which was attenuated by CDDO⁃Me（500.0 nmol/L）. Besides，hypoxia⁃
induced nuclear translocation of p65，phosphorylation of p65 protein，and the secretion of TNFα and IL⁃1β were inhibited by CDDO⁃
Me treatment. Conclusion：CDDO⁃Me can inhibit hypoxia⁃induced proliferation，migration，myofibroblast transformation of PAAF，
improve the antioxidation ability，and inhibit TGF⁃β1/Smad3 and NF⁃κB signaling pathway in PAAF.
［Key words］ pulmonary arterial hypertension；CDDO⁃Me；pulmonary adventitia fibroblast；hypoxia
［J Nanjing Med Univ，2021，41（09）：1273⁃1280］

肺 动 脉 高 压（pulmonary arterial hypertension， CDDO⁃Me 对缺氧诱导的 PAAF 活化后功能的影响
PAH）是一类以肺血管重构及肺血管阻力进行性升 并探讨其相关机制。
高为特征，右心室后负荷逐渐增加，最终导致右心
1 材料和方法
衰竭甚至死亡的进展性疾病。肺血管重构是 PAH
发生发展的重要病理基础，主要表现为肺血管内膜 1.1 材料
增生、中膜肥厚、外膜纤维化及炎症细胞浸润等 。 人 PAAF、成纤维细胞培养基（ScienCell 公司，
［1］
研究表明，肺动脉外膜是最早响应血管应激或损伤 美国），CDDO⁃Me（中国药科大学黄张建教授惠赠），
［2］
并发生病理改变的结构 。在缺氧、血管扩张等各 CCK⁃8 试剂盒（同仁公司，日本），转化生长因子
种因素的作用下，肺动脉外膜成纤维细胞（pulmo⁃ （transforming growth factor，TGF）⁃β1、肿瘤坏死因子
nary artery adventitia fibroblast，PAAF）作为肺动脉外 （tumor necrosis factor，TNF）⁃α、白细胞介素（interleu⁃
膜中主要的细胞成分首先被激活，主要表现为细胞 kin，IL）⁃1β ELISA 检测试剂盒（武汉华美生物），
的增殖、迁移能力显著增强，并可以向肌成纤维细 2′，7′⁃二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH⁃DA，Sigma公司，
胞转化，产生更多的细胞外基质（extracellular ma⁃ 美国），总谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒、丙
trix，ECM）、生长因子、趋化因子以及炎性细胞因子， 二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（上海碧云
［3］
调节血管壁细胞的生长，参与肺血管重构过程 。 天生物），总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，
缺氧可以诱导细胞产生大量活性氧（reactive SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。β⁃
oxygen species，ROS），当 ROS 的产生超过了机体抗 actin 抗体、α⁃平滑肌肌动蛋白（alpha⁃smooth muscle
氧化防御能力时，组织细胞便会出现基因突变、凋 actin，α⁃SMA）抗体、Ⅰ胶原蛋白（Collagen Ⅰ）抗体、
亡坏死、脂质过氧化等一系列氧化应激损伤。研究 羊抗兔/羊抗鼠二抗（武汉Proteintech 公司），波形蛋
表明，氧化应激可以诱导肺血管过度收缩、肺动脉 白（Vimentin）抗体（Abcam 公司，美国），NF⁃κB p⁃
内皮功能障碍以及肺血管重构，参与PAH的发生发 p65/p65 抗体、p⁃Smad3/Smad3 抗体（CST 公司，美
［4］
展 。核转录相关因子⁃2（nuclear factor erythroid⁃2 国），羊抗兔荧光二抗（Invitrogen公司，美国）。
related factor 2，Nrf2）是细胞防御氧化应激的主要转 1.2 方法
录调节因子，在维持细胞的氧化还原平衡及代谢中发 1.2.1 细胞培养及分组
挥重要作用 。甲基巴多索隆（bardoxolone methyl， 人 PAAF 培养于成纤维细胞完全培养基中（含
［5］
CDDO⁃Me）是一种新型三萜类齐墩果酸衍生物，可 2%胎牛血清、1%成纤维细胞生长因子、100 U/mL青
激活 Keap1/Nrf2/ARE 信号通路发挥抗氧化应激作 霉素及链霉素），置于 37 ℃、5%CO2的培养箱中培
用，在慢性肾病 、2型糖尿病 、急性肺损伤及肺纤 养。细胞生长至70%融合时分组处理，分为4组：常
［7］
［6］
维化 ［8-9］ 中具有潜在治疗作用。然而目前尚无研究 氧组、缺氧组、缺氧+CDDO⁃Me 组、常氧+CDDO⁃Me
报道其对缺氧诱导的PAAF的影响。本文旨在探索 组，其中缺氧组和缺氧+CDDO⁃Me组置于含5%CO2、