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第41卷第9期 彭丽瑶，魏桂红，黄张建，等. CDDO⁃Me对缺氧诱导的肺动脉外膜成纤维细胞活化的影响［J］.
2021年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1273-1280 ·1275 ·
1%O2缺氧箱中处理。CDDO⁃Me在放入缺氧箱前1 h 血清培养基洗涤细胞 3 次，置于荧光显微镜下观察
加入。 拍照。
1.2.2 CCK⁃8法检测细胞活力 GSH、MDA 和 SOD 检测：按照 1.2.5 方法收集细
收集对数生长期的人PAAF，按每孔1×10 个细 胞裂解液，按照试剂盒说明书操作，GSH 检测在
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胞接种于 96 孔板，常规培养 24 h 后弃培养基，按照 412 nm 波长处测定吸光度、MDA 检测在 532 nm 波
分组分别加入无血清培养基和无血清培养基配制 长处测定吸光度、SOD检测在450 nm波长处测定吸
的不同浓度CDDO⁃Me工作液。1 h后，将缺氧组及缺 光度。
氧+CDDO⁃Me组置入缺氧箱中培养。24 h后，弃培养 1.2.7 酶联免疫吸附实验（ELISA）
基，每孔加入含10% CCK⁃8原液的培养基100 μL，孵 人 PAAF 以 5×10 个/孔的密度接种于 24 孔板
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育 4 h，应用酶标仪于 450 nm 波长处检测吸光度。 中，隔天弃去培养基，药物处理1 h后分别置入不同
细胞活性=（实验组吸光度值-空白组吸光度值）/（对 培养箱培养，药物处理24 h后收集细胞上清，-80 ℃
照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%。 保存备用。取出细胞上清和ELISA检测试剂盒室温
1.2.3 Transwell迁移实验 复温30 min，按照试剂盒说明书操作，应用酶标仪于
收集对数生长期的人PAAF，PBS洗涤3遍后用 450 nm 波长处检测各孔吸光度值。应用 CurveEx⁃
无血清培养基将其重悬制成 1×10 个/mL 的细胞悬 pert 软件制作标准曲线，根据样本吸光度值计算细
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液，在 Transwell 上室中加入 100 μL 细胞悬液，下室 胞因子浓度。
中加入 600 μL 含所需药物的完全培养基。根据分 1.3 统计学方法
组，置于不同培养箱培养。24 h后取出小室，弃去上 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，所有数据以
室培养基，用棉签擦去小室膜上层细胞，多聚甲醛 均数±标准误（x ± sx ）表示，多组间样本统计分析采
固定，PBS 洗涤，结晶紫染色后于显微镜下观察，使 用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），组间两两比
用 Image⁃Pro Plus 图像分析软件分析每组迁移至下 较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。
室的细胞所占面积，计算细胞相对迁移率。
2 结 果
1.2.4 细胞免疫荧光分析
人PAAF以5×10 个/孔的密度接种于24孔板细 2.1 CDDO⁃Me 对缺氧诱导的 PAAF 细胞活力和迁
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胞爬片上，隔天弃去培养基，药物处理1 h后分别置 移的影响
于不同培养箱中培养24 h，PBS清洗后多聚甲醛固定 CCK⁃8实验结果显示，在常氧条件下，500.0 nmol/L
30 min，0.5% TritonX⁃100 PBS液洗涤20 min，5% BSA 及以下浓度的 CDDO⁃Me 对细胞活力的影响与对照
室温封闭1 h，随后加入一抗α⁃SMA、p65（1∶200），置 组相比差异无统计学意义（P > 0.05，图 1A），表明
于4 ℃冰箱孵育过夜，PBS清洗3次后加入免疫荧光 500.0 nmol/L 及以下浓度的CDDO⁃Me 对PAAF 无细
二抗（1∶1 000），置于室温孵育1 h。PBS清洗后每孔 胞毒性。缺氧刺激 24 h 可以显著增强 PAAF 细胞
加入Hoechst 33342染核30 min，PBS清洗后用抗荧光 活力，与常氧组相比差异有统计学意义（P < 0.05，
淬灭液封片，在荧光显微镜下观察拍照。 图 1B）；CDDO⁃Me 可以浓度依赖性地降低缺氧诱
1.2.5 Western blot 导的 PAAF 细胞活力的升高，并在 250.0 nmol/L 和
收集处理后的人PAAF，PBS洗3遍后加入预冷 500.0 nmol/L 浓度时具有显著抑制作用（P < 0.05），
的RIPA裂解液提取细胞总蛋白。常规SDS⁃PAGE凝 故使用 500.0 nmol/L 的 CDDO⁃Me 进行后续研究。
胶电泳、湿法转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，随 Transwell 迁移实验结果显示，与常氧组相比，缺氧
后加入一抗（1∶1 000）置于 4 ℃冰箱孵育过夜。 组细胞迁移数量显著增加，而缺氧+CDDO⁃Me 组细
TBST 洗膜后加入二抗（1∶8 000），室温孵育 1 h，洗 胞迁移数量显著减少（P < 0.05，图 1C、D），提示
膜后化学发光显影，使用Image Lab图像分析软件分 CDDO⁃Me 可以显著抑制缺氧诱导的 PAAF 迁移。
析蛋白表达量。 上述结果表明，缺氧可以诱导 PAAF 细胞活力和迁
1.2.6 氧化应激水平检测 移能力增强，而 CDDO⁃Me可以显著抑制上述改变。
ROS 检测：按照 1.2.4 方法培养细胞，24 h 后弃 2.2 CDDO⁃Me 对缺氧诱导的 PAAF 向肌成纤维细
去培养基，每孔加入无血清培养基稀释的DCFH⁃DA 胞转化的影响
（10 μmol/L），37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。用无 细胞形态学结果显示（图 2A），在常氧条件下
