Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第11期
·1518 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年11月

PVDF 膜浸于甲醇活化15 s，300 mA恒流转膜，根据 1.3 统计学方法
蛋白分子量大小设定转膜时间；5% BSA 室温封闭 使用 SPSS 20.0 统计软件，数据以均数±标准差
2 h；一抗（α⁃SMA、GAPDH、CD63、CD9）4℃孵育过夜 （x ± s）表示。两组之间比较用独立样本t检验，两组
后用 TBST 洗 3 遍，每次 15 min；室温孵育二抗 2 h 以上比较用单因素方差分析，方差齐时用Bonferroni
后用 TBST 洗 3 遍，每次 15 min；滴加 ECL 发光液于 分析，不齐时用Dunnett’s T3分析。P < 0.05为差异
膜上置于成像系统中曝光，用 Image J 软件行条带 有统计学意义。
灰度分析。
2 结 果
1.2.9 细胞免疫荧光染色
吸去细胞培养基，PBS 清洗，4% PFA 固定细胞 2.1 小鼠血浆外泌体鉴定
20 min，PBS 洗 3 遍，每次 5 min；0.1% TritonX⁃100 破 小鼠行心梗手术构建心脏纤维化模型，分别提
膜20 min，PBS洗3遍，每次5 min；5% BSA室温封闭 取假手术对照组和心梗手术心肌纤维化模型组小
2 h；吸去BSA，加α⁃SMA⁃Cy3抗体室温孵育2 h（全程 鼠的血浆外泌体，在电镜下观察到两组均可见圆形
避光，该抗体是一抗二抗联合抗体）；PBS洗3遍，每 双层囊泡（图 1A）。粒子跟踪分析仪检测两组外泌
次 5 min。荧光显微镜下观察拍照。用α⁃SMA 荧光 体的颗粒浓度均为 1.2×10 个/mL，平均粒径均为
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强度指示成纤维细胞的分化程度。 100 nm（图1B），符合外泌体分布特征。Western blot
1.2.10 EdU荧光染色 结果显示所提外泌体明显表达外泌体的标志蛋白
根据 kFluor488 Click⁃iTEdU kit 说明书步骤操 CD63和CD9（图1C）。
作（全程避光）：实验终点前 2 h，加 50 μmol/L EdUA 2.2 血浆外泌体对心脏成纤维细胞纤维化水平的
液至细胞培养液中，使 EdU 插入正在复制的 DNA 影响
中。配置反应液（Apollo 反应缓冲液+催化剂溶液+ Ang Ⅱ刺激原代小鼠心脏成纤维细胞在体外构
荧光染料溶液+缓冲添加剂）；细胞孔加入反应液， 建细胞纤维化模型，通过 qPCR 和 Western blot 分别
室温 30 min 后吸去，PBS 洗 3 遍，每次 5 min；加入 检测细胞两个具有代表性的促纤维化相关指标的
DAPI 反应液染细胞核，室温 30 min 后吸去，PBS 洗 水平（图2），结果显示：Ang Ⅱ刺激后，细胞的α⁃SMA
3 遍，每次 5 min。用 Edu 细胞数/DAPI 细胞数的比 和Ⅰ型胶原α1（collagen type Ⅰ alpha 1，col1α1）水
+
+
例指示细胞增殖率。 平均明显升高；添加对照组的血浆外泌体可以逆转

A B C
对照组外泌体 （×10）
4
对照组外泌体浓度 （ particlos/mL） 8 4 上清 外泌体 —50 kDa
12
对照组外泌体

0 CD63
0 100 200 3004005006007008009001 000 CD9 —25 kDa
粒径（nm）
心肌纤维化模型组外泌体 （×10） 心肌纤维化模型组外泌体
4
心肌纤维化模型组外泌体 （ particlos/mL） 8 4 CD63 —50 kDa
上清
外泌体
12
CD9
—25 kDa
浓度

0
0 100 200 3004005006007008009001 000
粒径（nm）
A：透射电子显微镜下血浆外泌体的形态（标尺：100 nm）。B：粒子跟踪分析仪检测血浆外泌体的浓度和粒径分布。C：Western blot检测血
浆外泌体标志蛋白的表达。
图1 小鼠血浆外泌体鉴定
Figure 1 Characterization of mouse plasma exosome