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第42卷第11期 顾寰宇，李姗姗，王 芹，等. 血浆外泌体通过微小RNA⁃25⁃3p对心肌纤维化影响的初步研究［J］.
2022年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（11）：1515-1522 ·1517 ·

鼓 楼 医 院 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 审 查（批 准 号 培养箱 2 h 行差速贴壁后吸去培养液，贴壁细胞即
2021AE01061）。 心脏成纤维细胞，加入新鲜细胞培养液后置于细胞
1.2.2 血浆外泌体提取（SBI试剂盒提取法） 培养箱用于后续实验。
根据 ExoQucik exosome precipitation solution 说 1.2.6 心脏成纤维细胞纤维化模型建立及细胞转染
明书步骤操作：将血浆样本与1/2体积的凝血活素D 在避光、无血清条件下，200 nmol/L AngⅡ处理细
充分混合；去除沉淀，留存上清，将上清与 Exoquick 胞48 h以构建细胞纤维化模型。miRNA模拟物和抑
试剂按体积4∶1混合均匀，室温放置30 min，1 500 g 制物的转染浓度分别为100 nmol/L和200 nmol/L，配
离心30 min，见管底有沉淀；去除上清，1 500 g离心 置转染体系（以 1 mL 为例，5 μL 模拟物或 10 μL 抑
5 min后去除上层液体组分；沉淀用1/10原始体积的 制物+200 μL DMEM+4 μL Lipo2000）吹打混匀；将
PBS重悬即得实验所需外泌体。 以上转染体系加入 800 μL 无血清培养液中，加入
1.2.3 外泌体RNA提取（SBI试剂盒提取法） 细胞培养板后放入细胞培养箱中培养，8 h 后换液
根据 Exosome RNA Purification Column kit 说明 1 次，48 h后收取细胞。
书步骤操作：外泌体沉淀加入 350 μL Lysis buffer， 1.2.7 细胞RNA提取及qPCR检测

震荡 15 s，静置 5 min；加入 200 μL Ethnaol 震荡 10 s 吸去培养液，PBS洗净，Trizol充分裂解细胞；加
后移入离心柱，13 000 r/min离心1 min；去除液体，离 入 Trizol 体积 20%的氯仿震荡 15 s，静置 5 min；4 ℃

心柱放回收集管后加入400 μL洗涤液，13 000 r/min 12 000 r/min离心15 min；上层相转移至另一无RNA
离心1 min，重复1次该步骤；去除液体，13 000 r/min 酶离心管中，加入等体积异丙醇；4 ℃ 12 000 r/min
离心2 min以干燥；去除收集管，换成干净无酶1.5 mL 离心 10 min，去上清后加入 1 mL 75%乙醇；4 ℃
离心管，加入 30 μL 洗脱液于离心柱，2 000 r/min 离 12 000 r/min离心10 min，弃上层乙醇后干燥10 min；
心2 min；13 000 r/min离心1 min，收集外泌体RNA。 加 30 μL DEPC 水溶解沉淀。NanoPhotometer 仪器
1.2.4 透射电镜及纳米颗粒跟踪分析鉴定外泌体 测定RNA浓度及纯度，参照试剂盒说明书行逆转录
外泌体溶液置于铜网上，用 2%醋酸双氧铀染 及 qPCR。制备 mRNA 的 qPCR 体系后置于定量
色 1 min，再置于灯下烤 10 min 后用电镜观察拍照。 PCR仪中，设定程序：95 ℃ ，3 min预变性；95 ℃ 15 s，
Zetaview粒子跟踪分析仪测量纯化的外泌体的浓度 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环，用 18 S 做内
和粒径分布。 参。制备 miRNA 的 qPCR 体系置于定量 PCR 仪中，
1.2.5 新生小鼠心脏成纤维细胞分离及培养 设定程序：95 ℃ 20 s预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，
高温灭菌器械和玻璃器皿，配置组织消化液 72 ℃ 10 s，共 40 个循环，用 5 S 做内参。引物序列
（Ⅱ型胶原酶 40 mg+胰酶 60 mg 加入 PBS 定容至 见表1。
100 mL），0.22 μm 滤膜过滤后待用。75%乙醇消毒 1.2.8 细胞蛋白提取及蛋白免疫印迹法
新生 3 d 内小鼠胸腹部皮肤，开胸取出心脏，在 PBS 吸去细胞培养基，PBS 清洗，加入细胞裂解液
中漂净后移至安瓿瓶内剪碎成匀浆状；碎组织移至 （以 100 μL 为例，100 μL 细胞裂解液+1 μL PMSF），
200 mL玻璃瓶，加入30 mL消化液，37 ℃ 110 r/min摇 刮板刮取细胞转移至 1.5 mL 离心管，冰上静置
床15 min，加入马血清终止消化；收集悬液1 000 r/min 30 min；4 ℃12 000 r/min 离心15 min，上清即蛋白溶
离心 5 min；弃上清，沉淀加入成纤维细胞培养液 液；BCA法测定蛋白浓度；蛋白溶液加入1/4体积的
（DMEM+10%FBS+1%双抗）重悬，多次重复以上步 含β⁃巯基乙醇的 5×Loading buffer 混匀，100 ℃煮蛋
骤至组织消化成白色絮状物。收集所有细胞悬液 白10 min，冷却后备用。配置分离胶和浓缩胶，将相
铺至 10 cm 细胞培养皿中，置于 37 ℃、5% CO2细胞 同质量的蛋白样本加入上样孔中，100 V电泳1.5~2 h；

表1 qPCR引物序列
Table 1 Primer sequences for qPCR
基因 上游（5′→3′） 下游（5′→3′）
col1α1 TCTAGACATGTTCAGCTTTGTGGA TCTGTACGCAGGTGATTGGTG
α⁃SMA GTCCCAGACATCAGGGAGTAA TCGGATACTTCAGCGTCAGGA
18 s CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC CGCCCAATACGACCAAATCCG
5 s CTCGCTTGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT