Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 24

第42卷第11期
               ·1516 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年11月


              血压长期作用下，心脏成纤维细胞增殖并向肌成纤                            ⁃25⁃3p在健康小鼠和心肌纤维化小鼠血浆外泌体中
              维细胞表型转化，特征性高表达α⁃平滑肌肌动蛋白                           含量的区别，并明确其与心肌纤维化的关系，为将
             （α⁃smooth muscle actin，α⁃SMA） 。肌成纤维细胞              来探索心肌纤维化的治疗靶点和诊断标志物提供
                                           ［3］
              有更强的增殖和分泌胶原的能力，使得胶原浓度高                            新思路。
              于正常水平，最终导致细胞外基质异常积聚，影响
                                                                1  材料和方法
              心脏的正常结构和功能 。心肌细胞外基质含量常
                                   ［4］
              被用于评估心肌纤维化程度，其胶原成分主要由Ⅰ                            1.1  材料
                               ［5］
              型和Ⅲ型胶原构成 。心肌纤维化的发生机制复杂                                 动物：SPF 级健康雄性 C57BL/6 小鼠 20 只，8 周
              且未明确，病理过程有众多细胞因子参与，如血管                            龄，体重 25~30 g，由杭州医学院提供［动物证许可
              紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）、转化生长因子β、                号：SCXK（浙）2019⁃0059］。自由饮食，喂养全价营
              血小板源性生长因子等 。炎症因子、肾素⁃血管紧                           养颗粒饲料。
                                   ［6］
              张素⁃醛固酮系统、氧化应激等因素经由相同或不同                                主要试剂：ExoQucik exosome precipitation solu⁃
              的信号转导通路如WNT/β⁃catenin、MAPK/ERK参与                  tion、Exosome RNA Purification Column kit（SBI公司，
              心肌纤维化的发生发展 。                                      美国）；水合氯醛（上海生工生物）；Ⅱ型胶原酶、胰
                                   ［7］
                  随着近些年研究的逐渐深入，外泌体被发现广                          酶、Ang Ⅱ、α⁃SMA⁃Cy3 抗体（Sigma 公司，美国）；马
                                             ［8］
              泛参与心血管系统的病理生理过程 。外泌体（exo⁃                         血清（BI 公司，以色列）；DMEM、胎牛血清（fetal bo⁃
              some）是一种由各种细胞分泌的直径 30~150 nm 呈                    vine serum，FBS）（Gibco公司，美国）；双抗、细胞裂解
              圆形小碟状的脂质双层囊泡，广泛存在于血液、尿                            液、PMSF、BSA、kFluor488 Click⁃iTEdU kit（南京凯基
              液、唾液、乳汁等各种体液中。主要由蛋白质和脂                            生物）；miRNA 模拟物/抑制物、miRNA 引物（广州锐
              质构成，包括融合蛋白、热休克蛋白、CD蛋白（CD9、                        博生物）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国）；
              CD63、CD81）及丰富的脂质 。外泌体可携带有功                        Trizol、焦碳酸二己酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）
                                       ［9］
              能活性的内容物，如蛋白质、核酸（DNA、mRNA、                         水、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京
              microRNA、lncRNA）、脂质等来进行细胞间的信息传                    诺唯赞生物）；SYBR GREEN、5× Prime Script RT
                                                                                    ®
              递，这种分子信号交换在生理和病理过程中都有重                            Master Mix、BCA Protein Assay Kit（TaKaRa 公司，日
              要作用   ［10］ 。研究表明小鼠胚胎干细胞来源的外泌                      本）；抗体（CD63、CD9、α⁃SMA、GAPDH）（武汉 Ab⁃
              体有支持心肌细胞存活和抗心肌纤维化的作用 。                            clonal公司）；ECL（上海Tanon公司）。
                                                         ［11］
              人脐带间充质干细胞来源的外泌体可减轻大鼠心脏                                 主要仪器：qPCR 仪、酶标仪（Thermo Fisher 公
                                           ［12］
              左前降支结扎引起的心肌纤维化 。所以外泌体可                            司，美国）；透射电子显微镜（JEM⁃200CX，JEOL 公
              能在心肌纤维化的发生发展中扮演了重要角色。                             司，日本）；Zetaview 粒子跟踪分析仪（Particle Metrix
                  外泌体包裹的生物活性成分微小RNA（microRNA，                   公司，德国）；荧光显微镜（Leica 公司，德国）；West⁃
              miRNA）在多种疾病中表达异常，被认为是一种有                          ern blot 电泳仪、转膜仪、曝光成像系统（Bio⁃Rad 公
              前途的标志物或治疗靶点            ［13］ 。miRNA是一类由20~         司，美国）；NanoPhotometer（IMPLEN公司，德国）。
              23个核苷酸组成的单链非编码小分子 RNA，它通过                         1.2 方法
              碱基互补配对和mRNA 3′ 端非翻译区结合，抑制靶                        1.2.1 小鼠心肌梗死模型构建及取样
                                     ［14］
              基因表达和下游蛋白合成 。研究报道miRNA与众                               小鼠称重，5%水合氯醛麻醉，仰卧位固定，四肢
              多心脏疾病相关，在心衰患者血浆中有多种miRNA                          皮下连接心电图电极。颈左侧胸前区脱毛并消毒，
              表达异常     ［15］ 。微小 RNA⁃25⁃3p（microRNA⁃25⁃3p，       气管切开插管，连接呼吸机。切开皮肤，分离肌肉，
              miR⁃92b⁃5p）在扩张性心肌病引起的急性心衰患者                       在小鼠第四肋间进入胸腔；打开心包膜，在冠状动
                              ［16］
              血清外泌体中上调 。                                        脉左前降支根部，用6⁃0 缝合线结扎；对照组行假手
                  miR⁃25⁃3p 是人染色体 7q22.1 基因簇的成员之                术，打开胸腔，不行血管结扎。冠脉结扎成功后逐
              一，目前对其研究主要集中在肿瘤领域，它参与多                            层关胸，缝合皮肤，消毒，脱离呼吸机观察小鼠呼
              种恶性肿瘤的发生发展。研究表明miR⁃25⁃3p有促                        吸，稳定后拔除气管插管，置于电热毯上，等待苏
              进心肌纤维化的作用          ［17］ 。目前尚无miR⁃25⁃3p在血          醒。术后常规饲养 3 周，麻醉，行眼眶采血，血浆混

              浆外泌体中的相关研究。本研究旨在初步探索miR                           合后行外泌体相关后续实验。本研究已通过南京
   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29