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第42卷第11期
               ·1524 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年11月


              间歇低氧（intermittent hypoxia，IH）、交感神经兴奋、             3，GFP⁃LC3）腺病毒（上海汉恒生物科技有限公司）；
              睡眠片段化、胸腔负压增加等病理生理特征的睡眠                            线粒体红色荧光探针、Lipofectamin2000（Thermofisher
              呼吸疾患。OSAHS的发病率近年来逐渐升高，据统                          公司，美国）；线粒体膜电位检测（JC⁃1）试剂盒（上海
              计，20 世纪末期 OSAHS 发病率在男性中高达 34%，                    碧云天生物技术有限公司）；蛋白提取试剂盒（江苏
                             ［1］
              女性中高达 17% 。OSAHS 与许多心血管疾病相                        凯基生物技术有限公司）。
                                                  ［2］
              关，如高血压、心律失常、冠心病、心衰等 。OSAHS                        1.2  方法
              不仅增加心血管疾病的发生率，还增加其死亡率 。                           1.2.1 实验细胞培养及分组
                                                         ［3］
              Mazzotti 等 报道约 26.3%的 OSAHS 患者患有心血                     大鼠心肌细胞 H9C2（中国医学科学院细胞库）
                       ［4］
              管疾病，约 17.6%的 OSAHS 患者会发生严重心血管                     采用含 10%胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔
              事件。IH 是 OSAHS 致病的主要病理特征。但目前                       培养基，培养于 37℃、5%CO2恒温箱中。实验分组：
              OSAHS致心血管疾病的具体机制仍未研究清楚。                           ①对照组、gAPN 组、IH 组、IH+gAPN 组；②对照siR⁃
                  线粒体自噬是选择性自噬的一种，对维持细                           NA 组、Parkin siRNA 组、IH+对照 siRNA 组、IH+
              胞稳态具有重要作用。线粒体自噬是一把双刃                              gAPN + 对 照 siRNA 组 、IH + Parkin siRNA 组 、IH +
              剑，一方面可通过降解损伤的线粒体维持线粒体                             gAPN+Parkin siRNA组。
              稳定，促进细胞存活；另一方面过度的线粒体自噬                            1.2.2 细胞IH模型建立
              也可导致细胞死亡         ［5-6］ 。但目前为止，线粒体自噬                    参照已发表文献建立细胞 IH 模型             ［10］ 。IH 模型
              在 IH 所致心肌损伤中起到保护或是损伤作用并不                          采用三气培养箱，通过调节N2、O2的浓度实现。将细
              清楚。                                               胞接种于含透气膜的 6 孔板上。使用含 1 μg/mL
                  脂联素是由脂肪组织分泌的细胞因子，具有抗                          gAPN 的培养基培养 H9C2 细胞，将细胞置于 37 ℃、
              炎、减轻胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化等机体保护                            5%CO2恒温箱中孵育24 h。接着将细胞置于三气培
              作用。脂联素在血浆中含量丰富，其活性形式主要                            养箱进行 IH 暴露，IH 循环：95%N2/5%CO2混合气体
              有 2 种：全长脂联素和球形脂联素（globular adipo⁃                 培养 10 min，21% O2/5% CO2/74% N2混合气体培养
                          ［7］
              nectin，gAPN） 。研究显示OSAHS患者血浆脂联素                    10 min，共循环 48 h。对照组细胞置于 21% O2/5%
              水平较健康对照人群下降，且下降程度与OSAHS严                          CO2/74% N2混合气体中培养48 h。收集细胞进行后
              重程度呈正比 。前期动物研究发现补充 gAPN 可                         续实验。
                           ［8］
              减轻 IH 所致心肌损伤 。因此推测脂联素水平的                          1.2.3 细胞凋亡检测
                                  ［9］
              下降参与了OSAHS所致心血管系统损伤，然而脂联                               使用流式细胞仪检测H9C2心肌细胞凋亡。培
              素心肌保护机制并未完全阐明。                                    养细胞，分别进行实验干预后，消化、离心收集
                  本研究通过建立 OSAHS 细胞模型，旨在探索                       H9C2心肌细胞。预冷PBS洗涤2遍，使用500 μL缓
              gAPN减轻IH所致心肌损伤的机制及线粒体自噬在                          冲液重悬细胞。接着加入 5 μL 膜黏连蛋白⁃5（An⁃
              其中的作用，为将来开发治疗OSAHS新药奠定理论                          nexin V）和 5 μL 碘 化 丙 啶（propidiumiodide，PI），
              基础。                                               37 ℃避光孵育 15 min。使用流式细胞仪检测细胞
                                                                凋亡。
              1 材料和方法
                                                                1.2.4 线粒体自噬检测
              1.1  材料                                                采用线粒体红色荧光探针与 GFP⁃LC3 腺病毒
                  gAPN（Biovision 公司，美国）；帕金蛋白抗体                  荧光共定位的方法进行线粒体自噬的检测。采用

             （Parkin）、B 淋巴细胞瘤/白血病⁃2（B⁃cell lymphoma/            GFP⁃LC3 腺病毒转染 H9C2 细胞。转染后，进行实
              leukemia⁃2，Bcl⁃2）蛋白抗体（Abcam公司，美国）；Bcl⁃2           验干预。接着，采用线粒体红色荧光探针避光孵育
              相关X蛋白质（BCL2⁃associated X protein，Bax）、β肌          30 min。使用激光共聚焦显微镜检测线粒体自噬。
              动蛋白（β⁃actin）抗体（Cell Signaling Technology 公        红色荧光、绿色荧光及黄色荧光分别代表线粒体、
              司，美国）；细胞培养板（Zellkontakt 公司，德国）；小                  LC3、线粒体自噬小体。
              干扰 RNA（siRNA）（上海吉玛制药技术有限公司）；                      1.2.5  线 粒 体 膜 电 位（mitochondrial membrane

              绿色荧光蛋白⁃微管相关蛋白轻链 3（green fluores⁃                  potential，MMP）检测
              cent protein⁃microtubule⁃associated protein light chain  使用JC⁃1试剂盒进行MMP检测。培养细胞，进
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