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第42卷第3期        施  良，尤琴琴，沙 鑫，等. 结直肠癌中SIRT5的表达与 F⁃FDG PET/CT标准化摄取值的关系
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                  2022年3月               及机制研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（03）：333-339                   ·335 ·

                GCTGGGAAATCAATCGACTT ⁃ 3′ ；反 向 序 列 ：5′ ⁃          0.05 为差异有统计学意义。
                AAACAAGTCGATTGATTTCCCAGCC⁃3′。KO 引物
                                                                  2  结 果
                退火后与 Lenti⁃CRISPRv2 载体连接，转化 DH5α细
                菌，涂于LB平板上生长14 h，挑单克隆入LB培养基                        2.1  SIRT5在结直肠癌组织中的表达情况及与临床
                转移到摇床摇动 30 min，送公司测序验证。验证正                        参数、疾病预后的相关性
                确的 KO 质粒与病毒包装质粒 gag 和 wvg 一起转染                        78例结直肠癌标本中，40例（51.28％）SIRT5高
                HEK293T 细胞，48 h 后收集培养液感染细胞，同时                     表达（图 1A），染色颗粒主要分布在胞浆中，而癌旁

                加 2 μL Polybrene（×1 000），感染 48 h 后，加 2 g/L        组织中 SIRT5 高表达率仅 48.72%（38/78）。相较于
                puromycin 筛选感染细胞。筛选 2 周后，鉴定细胞                     癌旁组织，癌组织中 SIRT5 高表达率明显较高（P <
                KO效率。                                             0.05）。对 SIRT5 在结直肠癌和癌旁组织免疫组化
                1.2.4 荧光素酶报告基因检测                                  结果进行半定量分析，结果显示 SIRT5 在结直肠癌
                    将细胞接种到 6 孔板上，报告质粒（p2.1）和对                     组织的表达远远高于癌旁组织（P < 0.01，图 1B）。
                照质粒（pSV40⁃Renilla）转染 24 h，然后在 20%的氧               SIRT5 的表达水平与结直肠癌的分化程度、肿瘤大
                气下暴露24 h。按照双荧光素酶检测试剂盒说明书                          小相关（P < 0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤分期、

               （Promega公司，美国）对细胞提取物进行分析。p2.1                      淋巴结转移无关（P > 0.05，表1）。78例结直肠癌患
                与pSV40⁃Renilla荧光强度的比率代表缺氧诱导因子                     者中，死亡21例，占随访总例数的26.9%；术后复发
                1α（hypoxia⁃inducible factor 1α，HIF1α）的转录活性。       18 例，占随访总例数的 23.1%。生存曲线表明相较
                1.2.5 免疫荧光检测                                      于 SIRT5 低表达的结直肠癌患者，SIRT5 高表达的
                    单层细胞在24孔板内的爬片上生长，弃培养液                         结直肠癌患者的总体生存率较低（P < 0.05，图
                后，PBS 清洗 3 次，3%~4%多聚甲醛固定，每孔用                      1C）。这些结果表明，SIRT5的高表达往往预示着结
                200 μL含0.25% Triton X⁃100的PBS清洗3次，200 μL          直肠癌患者预后不良。
                含 1% BSA 的 PBST，摇床上室温封闭 30 min；弃上                 2.2  结直肠癌原发病灶 F⁃FDG 摄取与 SIRT5、
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                清，加入合适浓度的一抗，摇床上室温孵育1 h，PBS                        GLUT1表达以及肿瘤分化的关系
                清洗 3 次后加入合适浓度的荧光二抗，摇床上室温                              当 SIRT5 表达的染色强度评分分别为 0、1、2、3
                避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次后加入 DAPI，室温静置                  时 ，结 直 肠 癌 的 SUVmax 值 分 别 为 11.04 ± 1.81、
                2 min；封片胶将其固定在载玻片上，荧光显微镜下                         13.31±3.21、15.76±3.76、20.11±3.25；即随着 SIRT5
                观察。                                               表达的增加，SUVmax逐渐增高（Spearman相关系数=
                1.2.6 细胞 F⁃FDG摄取和乳酸的测定                            0.648，P < 0.05，图 2A）。ROC 曲线分析提示，当
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                     F⁃FDG 摄取测定：12 孔板每孔铺 1×10 个细                  SUVmax=14.78 时，F⁃FDG PET/CT 可以预测 SIRT5
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                胞，用2 μCi/mL的 F⁃FDG无糖培养基1 mL培养1 h，                 的表达水平，其诊断灵敏度和特异度分别为 51.5%
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                弃培养基，PBS 清洗细胞 2 次，用 0.1 mol/L NaOH 溶              和 83.3%（图 2B）。2 个典型结直肠癌病例所示（图
                液1 mL裂解细胞，转移至γ计数管检查。乳酸检测：                         2C），SIRT5 高表达者结直肠癌的 SUVmax 高；SIRT5
                吸取4 μL细胞裂解液加入酶标板中，加入200 μL乳                       低表达者结直肠癌的SUVmax低。结直肠癌的分化
                酸检测工作液，37 ℃避光孵育 10 min；用酶联免疫                      程度越低，SUVmax 值越高（18.18±4.06 vs. 12.72±
                检测仪于530 nm波长处测定吸光度值；取稀释乳酸                         2.60，P < 0.01，图2D）；同时发现，SIRT5的表达水平
                标准品液，同法作标准曲线；按照标准曲线计算样                            也随着分化程度的减低而增高（2.14±0.74 vs. 1.10±
                本中的乳酸浓度，并通过细胞蛋白浓度校正，设3复                           0.77，P < 0.01，图 2E）。GLUT1 是影响肿瘤 F⁃FDG
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                孔做统计分析。                                           摄取最关键的因素，结直肠癌 GLUT1 高表达组的

                1.3  统计学方法                                        SUVmax 值显著大于结直肠癌 GLUT1 低表达组的
                    应用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料采                     SUVmax值（P < 0.05，图2F）。而Spearman相关分析
                用均数±标准差（x ± s）表示，组间差异采用 t 检验，                     显示，SIRT5 表达与 GLUT1 表达之间存在显著正相
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                率的比较采用χ 检验，总体生存率分析采用 Kaplan                       关（Spearman相关系数=0.527，P < 0.05）。
                ⁃Meier 法及 Log⁃rank 检验。数据结果采用 Graph⁃               2.3  SIRT5 对结直肠癌细胞糖酵解的影响及机制
                pad Prism 5 软件作图。所有实验重复 3 次。P＜                        通过 CRISPR/Cas 9 基因编辑技术在 DLD1 和
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