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第42卷第4期         吴汉章，陈 铖，谢彩蝶，等. miR⁃192⁃5p通过靶向Notch3减轻顺铂所致的肾小管上皮细胞
                  2022年4月                  凋亡［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（4）：484-490                    ·485 ·


                was significantly increased after miR⁃ 192⁃5p mimic transfection. The overexpression of miR⁃ 192⁃5p alleviated cisplatin⁃induced
                apoptosis of HK⁃2 cells and negatively regulated the expression of Notch3. The dual luciferase reporter assay results verified that miR⁃
                192⁃5p directly binds with 3’⁃UTR of Notch3. Conclusion：miR⁃192⁃5p can attenuate the apoptosis of renal tubular epithelial cells
                induced by cisplatin through directly inhibiting the expression of Notch3.
               ［Key words］ acute kidney injury；microRNA；apoptosis；signal transduction
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2022，42（04）：484⁃490］





                    急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种以            型培养物保藏中心）；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12
                肾功能突然下降为特征的临床综合征，其与住院患                            培养基（Gibco公司，美国）；顺铂（Cisplatin，Cis，Sigma
                者的高病死率、远期慢性肾病的进展及其他类型的                            公司，美国）；miR⁃192⁃5p 类似物（miR⁃192⁃5p mimic）
                器官功能障碍密切相关           ［1-2］ 。AKI 的主要特点是近           及其配对阴性miRNA类似物（negative control miRNA
                端小管上皮细胞损伤和炎症，肾小管上皮细胞的功                            mimic，NC mimic）、miRNA 相 关 PCR 引 物（茎 环
                能障碍在缺血或毒性作用导致AKI的进展中起着关                           法）、miRNA 转染试剂盒（广州锐博）；TRIzol 试剂
                键作用，但其潜在机制尚未完全阐明                ［3-4］ 。          （Invitrogen 公司，美国）；PrimeScript 反转录试剂
                                                                                                   TM
                    Notch 信号是一种高度保守的细胞间通信机                        盒、TB Green实时定量PCR试剂盒（TaKaRa公司，日
                制，可调节细胞发育、组织稳态及修复。近年来一                            本）；miRNA反转录试剂盒（茎环法）、miRNA实时定
                系列研究表明 Notch 信号是肾脏发育、损伤和修复                        量 PCR 试剂盒（南京诺唯赞）；全蛋白提取试剂盒、
                                                   ［6］
                                     ［5］
                过程中的关键调节因子 。Kavvadas 等 在缺血再                       BCA 法蛋白测定试盒（南京凯基）；Notch3 兔多克隆
                灌注肾损伤小鼠模型中发现 Notch3 异常高表达并                        抗体（Abcam 公司，英国）；Caspase3 和 GAPDH 抗体
                证实 Notch3 参与了肾脏炎症反应并导致肾小管上                       （Proteintech公司，美国）。
                皮细胞损伤，靶向Notch3或可为急性肾损伤提供一                         1.2  方法
                种新的治疗策略。然而 Notch3 在顺铂诱导的肾小                        1.2.1  细胞培养与分组
                管细胞损伤中的作用及其异常高表达的相关机制                                 HK⁃2 细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培
                尚未阐明。                                             养液于 37 ℃ 5% CO2 的细胞培养箱中培养。待细
                    微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源                  胞生长至 70%~80%融合状态时用胰蛋白酶消化
                基因编码的非编码单链 RNA 分子，其长度约为 19~                       传代，接种于 6 孔板后待细胞生长至 70%~80%融
                25个核苷酸，它们通过翻译抑制或促进RNA降解来                          合状态用无血清培养基同步化培养 24 h。实验
                介导靶基因的转录后调控，从而参与各种生理和病                            分为：①NC mimic 组（NC）；②NC mimic+Cisplatin
                理过程 。在 AKI 的病理过程中，它们通过调节细                         组（NC+Cis）；③miR⁃192⁃5p mimic 组（OE）；④miR⁃
                      ［7］
                胞凋亡、程序性死亡、炎症和细胞增殖等在肾脏的                            192⁃5p mimic+Cisplatin 组（OE+Cis）。 分 别 转 染
                损伤和修复中发挥重要作用             ［8-9］ 。然而，目前还没有         （NC mimic、miR⁃192⁃5p mimic，加 或 不 加 顺 铂
                关于 miRNA 在顺铂诱导 AKI 过程中调控或靶向                       20 μmol/L作用24 h后，提取总RNA、总蛋白。
                Notch3的相关研究报道。                                    1.2.2  实时荧光定量PCR

                    因此，本研究拟寻找靶向 Nocth3 的潜在 miR⁃                       按上述步骤干预细胞 24 h 后用 TRIzol 氯仿⁃异
                NA，通过体外培养人肾小管上皮细胞，并转染相关                           丙醇法提取细胞总 RNA，按照 miRNA 反转录说明
                miRNA 类似物（mimics）以探讨相关 miRNA 调控及                  书进行反转录，合成 cDNA，反应体系 10 μL，反转
                靶向 Notch3 在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的                        录 条 件 ：42 ℃ 2 min，25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，
                作用，以期为防治肾小管坏死及急性肾损伤提供新                            85 ℃ 5 min。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL，
                的思路。                                              反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循
                                                                  环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。mRNA 实时定
                1 材料和方法
                                                                  量 PCR，按照 mRNA 反转录说明将 RNA 反转录成
                1.1  材料                                           cDNA，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。实时荧光
                    人近端肾小管上皮细胞株（HK⁃2 细胞，中国典                       定量PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，
   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40