Page 36 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第4期
               ·486 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年4月


              40 个循环。引物序列：内参β⁃actin 上游 5′⁃AT⁃
                                                                2 结     果
              GAAATCGCCGCACTG ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃ TGAGCCTC⁃
              GTCTCCCAC ⁃ 3′ ，Notch3 上 游 5′ ⁃ TCAGGCTCT⁃        2.1  顺铂处理后肾小管上皮细胞 Notch3 及凋亡相
              CACCCTTGG⁃3′，下游 5′⁃AGTCACTGGCACGGTTG⁃             关蛋白cleaved⁃caspase3的表达及细胞凋亡率情况
              TAG⁃3′。采用 LightCycler96 实时荧光定量 PCR 仪                   流式细胞分析示顺铂处理组细胞凋亡率明显
             （瑞士罗氏公司）。miRNA 以 U6 为内参，mRNA 以                     升高（图1A）；同时Western blot 结果表明，与正常对
              β⁃actin 为内参，根据所得 Ct 值，运用 2          - ΔΔCT 相对定    照组比较，顺铂处理组 Notch3 及凋亡相关蛋白
              量法分别计算 miRNA 及目的基因 mRNA 相对表                       cleaved⁃caspase3表达均显著升高（P < 0.05，图1B）；
              达量。                                               实时荧光定量 PCR 表明，同正常对照组比较，顺铂
              1.2.3  Western blot                               处理组细胞Notch3 mRNA表达显著上调（P < 0.001，

                  各组细胞按上述步骤干预24 h后用预冷的RIPA                      图 1C）。既往研究已报道药理性抑制 Notch 信号通
                                                                                                   ［10］
              裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白酶抑制剂裂                          路可以减轻顺铂诱导的HK⁃2细胞凋亡 ，综上提示
              解，提取总蛋白。测定蛋白浓度并配成统一浓度，加                           Notch3或在顺铂所致的小管损伤中也起重要作用。
              入上样缓冲液，沸水加热 5~10 min。制备 5%浓缩                      2.2  靶向Notch3的潜在miRNA的筛选和检测
              胶和 8%、10%分离胶，取 30~50 μg 总蛋白行十二                         使用公共预测平台 Targetscan 检索与 Notch3
              烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）                         的 3′⁃UTR 结合的潜在 miRNA。然后，从既往的

              分离蛋白分子，300 mA 恒流电转膜，室温下 5%                        研究中选取了微阵列测量肾损伤样本中下调的
              脱脂奶粉溶液封闭 1 h，分别加入一抗（Notch3 抗                      miRNA ［11］ 。两者取交集，从中选取1个miRNA（miR⁃
              体，1∶1 000；Caspase3抗体，1∶1 000；GAPDH抗体，             192⁃5p）行进一步分析，实时荧光定量 PCR 表明，同
              1∶2 000）后 4 ℃过夜。TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，            正常对照组比较，顺铂处理组细胞miR⁃192⁃5p表达
              加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）室温                         显著下调，差异有统计学意义（P < 0.01，图2）。
              摇床孵育 1~2 h 后，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。               2.3  miR⁃192⁃5p mimic的转染效率检测
              电化学发光液（ECL）显色，凝胶成像系统图像扫                                转染 24 h 后，实时荧光定量 PCR 检测结果显
              描，Image J软件行结果分析。                                 示，与NC mimic组比较，miR⁃192⁃5p mimic组肾小管
              1.2.4  流式细胞仪分析                                    细胞内 miR⁃192⁃5p 明显升高，差异有统计学意义
                  用不含 EDTA 的胰酶消化收集细胞，PBS 洗涤                     （P < 0.001，图3A）。
              细胞 2 次（1 000 r/min，离心 5 min），弃去上清，加               2.4  miR ⁃ 192 ⁃ 5p 对 顺 铂 所 致 肾 小 管 上 皮 细 胞
              入 500 μL 的 Binding Buffer 重悬细胞后加入 5 μL            Notch3、凋亡相关蛋白 cleaved⁃caspase3 的表达及细
              Annexin V⁃FITC 与5 μL碘化丙啶（propidium iodide，        胞凋亡率的影响
              PI），混匀、室温避光反应 5~15 min，1 h 内行流式细                       将 miR⁃192⁃5p mimic 与 NC mimic 分别转染至
              胞仪检测。                                             HK⁃2 细胞，加或不加顺铂处理 24 h 后，实时荧光定
              1.2.5  双荧光素酶报告基因检测                                量 PCR 检测及 Western blot 检测结果显示，同为顺
                  带有 miR⁃192⁃5p 预测结合位点的 Notch3 定向               铂处理诱导细胞凋亡情况下，与 NC+Cis 组比较，
              缺失突变型（Notch3⁃MUT）和野生型（Notch3⁃WT）                  过表达 miR⁃192⁃5p 明显降低了 Notch3 mRNA 及蛋

              3′⁃UTR 的 荧 光 素 酶 报 告 载 体 单 独 或 与 miR⁃             白水平（P < 0.01，图 3B、C）。同时，过表达 miR⁃
              192⁃5p mimic 共转染至 293T 细胞中，细胞裂解后，                 192⁃5p 后肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白 cleaved⁃
              按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，采用                            caspase3 表达及细胞凋亡率均明显降低，差异有统
              酶标仪检测荧光素酶活性。                                      计学意义（图 3D）。
              1.3  统计学方法                                        2.5  miR⁃192⁃5p与靶基因Notch3的靶向关系验证
                  所有数据均使用 SPSS22.0 软件进行分析。每                          双荧光素酶报告实验检测发现过表达 miR⁃
              个实验重复3次，计量数据以均数±标准差（x ± s）表                       192⁃5p 可以降低 pmiR⁃Notch3 3′⁃UTR⁃WT 的荧光
              示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分                         素酶活性，其活性下降 39%（P < 0.01），而 pmiR⁃
              析（one⁃way ANOVA），两两比较采用 LSD⁃t 检验。                 Notch3 3′⁃UTR⁃Mut 与 miR⁃192⁃5p mimic 共同转染
              P < 0.05为差异有统计学意义。                                细胞的荧光素酶活性未见明显变化，以上结果证
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