Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第5期
               ·620 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年5月


              研究忽略了肠道是由不同的区域组成，具有不同的                            样品滴加1％阿利新蓝染液（pH 2.5），室温放置10~
              解剖和生理功能特征。因肠道组织结构及肠道菌                             20 min，冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次。滴加高碘酸
              群分布的差异，不同肠段对营养物质的吸收也各不                            溶液，室温放置10 min。再次冲洗1次，再用蒸馏水
                  ［5］
              相同 ，空肠是营养吸收的主要区域，而回肠在免疫                           浸洗2 次。滴加Schiff 试剂，室温放置10~15 min。纯
              调节中起更重要的作用 。目前尚无关于HFD对不                           水冲洗。逐级常规乙醇脱水后中性树胶封固。每
                                   ［6］
              同部位小肠功能影响的研究。                                     组于光学显微镜下随机选取3个PAS 染色的组织隐
                  本研究通过对小鼠空回肠上皮绒毛、隐窝形                           窝区域进行观察。
              态、杯状细胞数量和功能、干细胞增殖分化能力的                            1.2.5 实时荧光定量PCR
              研究，初步探讨 HFD 对不同部位小肠功能的影响，                              取小鼠小肠组织，提取组织RNA，并测定RNA的
              为空回肠在 HFD 导致的肥胖及炎症中的不同作用                          含量和纯度。将RNA逆转成cDNA 为模板，用相关
              和机制研究提供基础。                                        引物进行 RT⁃PCR 扩增。实时定量 PCR（ABI7000，
                                                                StepOne⁃Plus，美国）。总反应体系为 10 μL，反应条
              1  材料和方法
                                                                件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸
              1.1  材料                                           15 s，40 个循环；72~94 ℃，每升高0.5 ℃读1 次制备熔
                  雄性 C57BL/6J 小鼠 40 只，8 周龄（江苏集萃药                解曲线。以actin 基因作为内参，引物序列详见表1。

              康生物科技股份有限公司），SPF级环境，温度（23 ±
                                                                               表1   PCR 引物序列
              1）℃。荧光定量 PCR 仪 ABI7000 StepOne⁃Plus（ABI                      Table 1 PCR primer seguences
              公司，美国）。生长因子EFG、R⁃spondin 1、Noggin 和
                                                                  基因名称                 引物序列（5′→3′）
              Wnt3a（Pepro Tech 公司，美国），3D 培养基质 Matri⁃
                                                                  β⁃actin      F：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT
              gel 356231（Corning公司，美国）。
                                                                               R：CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC
              1.2  方法                                             P53          F：TTCTGTAGCTTCAGTTCATTGG
              1.2.1 构建HFD小鼠模型                                                  R：ATGGCAGTCATCCAGTCTTC
                  将小鼠随机分配到正常饮食组（normal chow diet，                 Perp         F：TGTTCTAACGTGGCTGAGGTT
              NCD，n=20）或 HFD 组（n=20），分别喂养 3 个月。                                R：GTGACAGTGGTGACCCTCCT
              HFD热卡来源组成：60%由脂肪提供，20%由碳水化                          Bbc3         F：TGAGCCAAACCTGACCACTA
              合物提供，20%由蛋白质提供。小鼠自由饮水，每周                                         R：GCAGAGCACAGGATTCACAG
                                                                  H2afx        F：CGTCTTTGCTTCAGCTTGGT
              测量体重，记录摄食情况。
                                                                               R：CCGGTAAGCGTCTCTCTGAC
              1.2.2 小肠上皮组织分离
                                                                  Irs1         F：CCTGGGTCAGACAAAGAACC
                  脱颈法处死小鼠后取出整个肠道（小肠：从幽门
                                                                               R：CCCACCTCGATGAAGAAGAA
              至回盲部连接；十二指肠：距幽门5 cm；空肠：中间段
              小肠的中间部10 cm，回肠：靠近回盲肠部的10 cm）。                     1.2.6 小肠上皮分离隐窝及3D类器官培养
              1.2.3 石蜡切片及HE染色                                        小鼠处死后冰上分离出10 cm肠管并纵行切开，
                  4％甲醛固定 24 h，修剪组织后脱水，依次进行                      将小肠腔面的黏液及绒毛完整刮除后，用含100 U/mL
              75%酒精4 h→85%酒精2 h→90%酒精1 h→无水乙                    青霉素，10 mg/mL链霉素的DPBS清洗4~5次直至上

              醇Ⅰ30 min→无水乙醇Ⅱ30 min→醇苯 5~10 min→                 清液澄清。将处理过的小肠组织放入2 mmol/L EDTA
              二甲苯Ⅰ5~10 min→二甲苯Ⅱ5~10 min→蜡Ⅰ1 h→                  消化液中，4 ℃摇床孵育直至充分螯合（60 min），
              蜡Ⅱ 1 h→蜡Ⅲ 1 h。常规包埋。将包埋好的蜡块                        用 5 mL 移液枪用力吹打，直至 50%~80%的隐窝单
              置于切片机上切片，４℃冰箱保存。取石蜡切片，常                           位从固有层脱落，收集富集隐窝的吹打液，70 μm过
              规脱蜡，苏木素染液 3~5 min，然后伊红染液中染色                       滤，4 ℃ 300 g离心5 min，获得隐窝沉淀。将隐窝沉
              5 min。常规脱水后用中性树胶封片。每组于光学                          淀与液体状态的基质胶Matrigel按1∶2混合，将含有
              显微镜下随机选取3个HE染色的区域进行观察。                            隐窝单位的 Matrigel 滴在 24 孔培养板的孔中心，形

              1.2.4  过碘酸希夫（periodic acid⁃Schiff，PAS）糖原          成半球状，聚合成固态的3D立体结构。加入现配的
              染色                                                完全培养液DMEM/F12（Gibco 公司，美国）、N2 Sup⁃
                  取小鼠小肠组织石蜡切片，常规包埋、复水。                          plement（Life Technologies 公司，美国）、B27 Supple⁃
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