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第42卷第5期      黄煜龙，李晨露. 缺氧通过HIF⁃1α介导细胞内YAP1降低骨肉瘤细胞对CDDP的敏感性及机制［J］.
                  2022年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（05）：638-643                       ·639 ·


                    骨肉瘤是一种严重危害儿童和青少年健康的                           染 pcDNA⁃3.1⁃YAP1⁃HA 质粒）。按 Lipofectamine      TM
                原发性骨肿瘤      ［1-4］ 。铂类药物化疗是骨肉瘤的重要                  2000 说明书进行转染操作，转染 48 h 后收集细胞，
                治疗方式之一，但患者往往对化疗药物耐药，导致                            Western blot检验转染效率。
                疗效和生存率均受到极大影响               ［1-4］ 。化疗药物耐药         1.2.2  Western blot 检测 HIF⁃1α、YAP1、p⁃STAT3 和
                是目前骨肉瘤治疗的主要障碍，因此探索骨肉瘤耐                            总STAT3蛋白表达
                药机制已成为近年来骨肉瘤治疗研究的重要内                                  收集经处理的各组细胞，加入RIPA裂解液提取
                容。骨肉瘤作为实体肿瘤的一种，已被证实存在缺氧                           总蛋白，BCA 法进行定量。取等量蛋白进行SDS⁃聚
                微环境，其与骨肉瘤化疗耐药密切相关，但缺氧诱导                           丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5% 脱脂奶粉溶液封闭1 h，
                骨肉瘤产生耐药的机制目前尚未完全清楚                    ［5-7］ 。Yes  分别加入一抗 HIF⁃1α（1∶1 000）、YAP1（1∶1 000）、

                相关蛋白 1（yes⁃associated protein 1，YAP1）是 Hippo      p⁃STAT3（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、GAPDH（1∶
                信号通路中的重要激酶，其过表达不仅与骨肉瘤的                            10 000），于 4 ℃孵育过夜，清洗后加入 HRP 标记的
                发生发展密切相关        ［8-9］ ，也参与骨肉瘤化疗耐药的调               兔二抗（1∶5 000）室温孵育 2 h，清洗后加入 ECL 发
                控 ［10- 11］ 。既往研究证实，缺氧可引起肿瘤细胞内                     光剂于暗室中显影、曝光。采用Gel⁃Pro软件对蛋白
                YAP1 表达上调     ［12］ 。然而，缺氧是否通过上调细胞                 灰度值进行定量分析，以GAPDH为内参。
                内 YAP1 表达进而诱导骨肉瘤发生化疗耐药，目前                         1.2.3 CCK⁃8法检测MG⁃63细胞耐药性的改变
                尚未见相关报道。本研究拟在体外缺氧环境下培                                 将各组经处理的MG⁃63细胞按1×10 个/孔接种
                                                                                                      4
                养骨肉瘤细胞系 MG⁃63，观察在缺氧条件下 MG⁃63                      于 96 孔板中，加入 CDDP（10 μmol/L）继续培养 24 h
                细胞中 YAP1 的表达情况，探讨其对缺氧条件下骨                         后，每孔加入10 μL CCK⁃8试剂，37 ℃继续培养1.5 h，
                肉瘤细胞顺铂敏感性的影响及潜在机制。                                酶标仪检测 450 nm 处各孔光密度值。细胞相对活
                                                                  力为实验组与对照组的光密度比值。
                1  材料和方法
                                                                  1.2.4 Annexin V流式细胞术检测MG⁃63细胞凋亡
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                1.1  材料                                               收集经处理的各组MG⁃63细胞（1×10 个），PBS
                    MG⁃63 细胞（中国科学院上海细胞生物学研究                       洗涤后加入 5 μL PI 和 5 μL AnnexinV 试剂，混均后
                所）；DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国）；脂                     室温避光孵育 15 min，采用 FACS 流式细胞仪进行
                                TM
                质体Lipofectamine 2000、增强型ECL试剂盒（Invitro⁃           检测，用Cell Quest软件分析凋亡细胞的比例。
                gen公司，美国）；抗⁃YAP1、抗⁃HIF⁃1α、抗⁃STAT3、抗⁃              1.3  统计学方法
                磷酸化STAT3、抗⁃GAPDH 抗体（Cell Signaling Tech⁃              所有数据均采用SPSS 13.0 软件进行分析，正态
                nology 公司，美国）；HRP 标记山羊抗兔二抗（Santa                  分布的检测数据采用均数±标准差（x ± s）表示，两组
                Cruz 公司，美国）；CCK⁃8、Annexin V 凋亡检测试剂                间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用 One⁃
                盒（上海碧云天公司）；HIF⁃1α⁃siRNA、YAP1⁃siRNA、               Way ANOVA分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
                STAT3⁃siRNA 及对应阴性对照 siRNA（上海吉玛公
                                                                  2  结 果
                司）；顺铂（cisplatin，CDDP）（Sigma公司，美国），pcD⁃
                NA⁃3.1⁃YAP1⁃HA质粒为本研究室保存。                          2.1 缺氧条件下MG⁃63细胞中YAP1的表达
                1.2  方法                                               MG⁃63 细胞分别在常氧和缺氧条件下培养
                1.2.1 细胞缺氧处理与转染                                   24 h，Western blot 检测结果（图1）显示，缺氧组细胞
                    MG⁃63 细胞置于 DMEM 完全培养基（10%胎牛                   中 YAP1 蛋白的表达水平较常氧组显著升高（P <

                血清、100 μg/mL 链霉素和 100 U/mL 青霉素），37 ℃              0.05）。
                含 5% CO2 的湿润气氛中培养。细胞融合度达到                         2.2 沉默YAP1增加缺氧条件下骨肉瘤细胞对CDDP
                70%后，分别置于正常和缺氧条件下培养，缺氧条件                          的敏感性
                为：37 ℃、5% CO2、94% N2、1%O2。将处于生长对数期                    CCK⁃8检测结果（图2A）显示，CDDP（10 μmol/L）
                的MG⁃63 细胞接种至 6 孔板，siRNA 转染分为 3 组：                 处理24 h后，常氧组和缺氧组细胞活力均显著下降
                空白对照组（不转染）、阴性对照组（转染阴性对照                          （P < 0.01），常氧组细胞活力显著低于缺氧组（P <
                siRNA）和siRNA组（转染相应的siRNA）。质粒转染分                   0.01）。在 MG⁃63 细胞中用 siRNA 抑制 YAP1 表达，
                为2组：空载体组（转染对照空载质粒）和过表达组（转                         Western blot 检测结果（图 2B）显示，缺氧条件下 si⁃
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