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第42卷第5期 韩 玉，何 薇，吴桢珍，等. 原发性肺腺样囊性癌及黏液表皮样癌的基因突变及表达谱系构建［J］.
2022年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（05）：684-689 ·685 ·

在2015年版WHO 肺肿瘤分类中，肺涎腺肿瘤 针，捕获的文库与链霉亲和素磁珠结合，去除非特
包括腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）、黏液 异性结合的文库。
表皮样癌（mucoepidermoid carcinoma，MEC）、上皮肌上 RNA建库：提取的RNA通过KAPA建库试剂盒
［1］
皮癌、多形性腺瘤 ，以前两者最常见。肺涎腺肿 进行处理，首先通过 RiboErase 去除核糖体核糖核
瘤生长常较慢，对于病灶局限的肿瘤组织，手术切 酸（ribosome ribonucleic acid，rRNA），进一步去除
除是首要治疗方式 ，但对于无法手术的患者，想要 RNA 样本中的 DNA 残留，利用纯化的 RNA 进行互
［2］
探究更多的治疗方案，需要对肺涎腺肿瘤的发生发 补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic ac⁃
展机制有更深的研究，目前对肺涎腺肿瘤的报道主 id，cDNA）合成，进一步合成互补链，末端修复，接头
要包括一般情况、临床特征、预后，且多为个案报道 连接和文库扩增用于后续上机测序。RNA 部分检
和临床分析，在疾病发生、转移等机制方面的研究 测无富集流程。

较少。高通量测序，又称下一代测序（next genera⁃ 上机测序：按照 Hiseq 4000 使用说明准备测序
tion sequencing，NGS）能够准确检测被检测组织所 试剂，将表面标记的流式细胞上机测序；选用paired⁃
有的基因结果，且因其能快速、准确地检测而被广 end程序（基因片段采用桥式扩增法，而未经过环化
泛用于肿瘤患者的基因检测，具有检测量大、精确 的方式）进行双端测序，测序过程由Illumina提供的
度大的优势。本研究通过 NGS 检测技术从 DNA 及 数据收集软件进行控制，并进行实时数据分析取得
RNA两个层面对肺ACC、肺MEC进行全面分析。 原始测序序列，使用Q30（原始数据中测序碱基质量
数值大于30的碱基数量占总碱基数量的百分比）标
1 材料和方法
准去除达不到标准的碱基；去除PCR扩增过程中产
1.1 材料 生的重复数据。
研究纳入 2017 年 5 月—2020 年 7 月南京医科 1.2.2 生物信息学分析
大学第一附属医院、常州市第一人民医院、镇江市 DNA 生物信息学分析：测序下机数据为 bcl 格
第一人民医院共计 39 例患者，其中，ACC 14 例， 式，使用 bcf2fastq（v2.17.1.14，Illumina 公司）软件将
MEC 24 例，1例患者因病理不清在后续基因检测过 其转换为 FASTQ（版本：Illumina 1.8+）格式。通过
程中被剔除。本研究经南京医科大学第一附属医 Trimmomatic软件进行原始测序数据质控，去除低质
院伦理委员会批准（伦理审批号：2022⁃SR⁃254），患 量 reads（高通量测序仪产生的测序数据）；通过
者经手术、支气管镜及经皮肺穿刺获取组织送检病 BWA 软 件（https：//github.com/lh3/bwa/tree/master/
理前均已签署知情同意书，收集患者的肿瘤组织样 bwakit）将得到的 DNA 序列与人源基因组序列 hg19
本及可获取到的部分癌旁样本用于后续分析。所 比对。使用基因组分析工具包 GATK 3.4.0（https：//
有病例的肺涎腺肿瘤均为原发。 software.broadinstitute.org/gatk/）进行插入缺失突变
1.2 方法 和碱基质量进行评分，用 VarScan2 检测体细胞突
1.2.1 组织基因检测 变。体细胞突变保留标准：对于在 COSMIC 数据库
采用 QIAGEN DNA 和 QIAGEN RNA 提取试剂 中报道超过 20 次的基因突变，最小突变丰度阈值
盒进行组织样本 DNA 及 RNA 的提取，实验操作流 （VAF）=1.0%，且至少有3根突变reads支持，对于其

程参照提取试剂盒说明书。分别对提取后的 DNA 他突变 VAF=2.0%，且至少有 5 根突变 reads 支持。
和 RNA 进行 Qubit 定量，其中 DNA 提取总量不低于 此外，所有突变还需要满足最小测序深度≥ 20，最小
200 ng，RNA提取总量不低于200 μg。 碱基质量≥25，reads 偏倚不大于 10%的标准。采用
DNA 建库富集：提取好的 DNA 样本经超声打 ANNOVAR 对单核苷酸多态性（SNP）和 Indel（插入/
断，末端修复、接头连接、纯化基因后Qubit 定量，选 缺失）注释，数据库：dbSNP（单核苷酸多态性数据

取片段化处理后平均大小 250~300 bp 的片段 DNA 库）（v137）、1 000Genome（千人基因组数据库）、Ex⁃
进入测序流程；对选择的片段进行 PCR 扩增及纯 AC（外显子组整合数据库）、COSMIC（癌症中体细胞
化、文库定量及 PCR 扩增效率计算构建测序文库。 突变目录）（v70）、ClinVAR和SIFT（尺度不变特征转
DNA 富集选择南京世和基因生物技术股份有限公 换）数据库。1000Genome 或 ExAC 项目中群体频率
司自研的 416 panel 进行肿瘤相关基因富集。将基 大于1%的突变被删除。进一步通过内部同一测序
因捕获探针与文库杂交，加入引物、杂交溶液、探 平台收集的随机测序错误数据库对得到的突变结