Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
               ·760 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年6月


              like 2，OSBPL2/ORP2）是 OSBP/ORP 家族成员，与其             （5174S）（CST 公司，美国）、OSBPL2（A14199）（武汉
              他 ORP 成员相比，仅含 FFAT（phenylalanines in an           爱博泰克生物科技有限公司）、放线菌酮（cyclohexi⁃
              acidic tract）和OSBP相关配体结合结构域（OSBP⁃re⁃              mide，CHX，S7418）（上海Selleck 公司）、免疫（共）沉
                                            ［4-5］
              lated ligand binding domain，ORD）  。本课题组前          淀（Co⁃immunoprecipitation，Co⁃IP）试剂盒（abs955）
              期研究结果显示，OSBPL2突变是人常染色体显性遗                         （北京爱必信生物技术有限公司），HA⁃Tag（3724S）、
              传性耳聋（DFNA67）的分子病因，OSBPL2 缺失与胆                     Ubiquitin 抗体（3936）（CST 公司，美国），K48 抗体
              固醇代谢紊乱和肥胖表型相关              ［5-8］ 。本课题组在前期         （A18163）（武汉爱博泰克生物科技有限公司）、K63
              研究中发现，OSBPL2通过与其他效应蛋白的互作介                         抗 体（ab179434）（Abcam 公 司 ，美 国）、Flag 抗 体
              导了细胞内胆固醇合成、脂滴分解和脂肪前体细胞发                           （14793）（CST 公司，美国）、乳胞素（XY⁃LC26246）
              育与分化等过程        ［7-9］ 。其中，去泛素化酶泛素特异性               （上 海 熹 垣 生 物 科 技 有 限 公 司）、PSMD2 抗 体
              蛋白酶 14（ubiquitin⁃specific peptidase 14，USP14）也    （A1999）（武 汉 爱 博 泰 克 生 物 科 技 有 限 公 司）、
              是OSBPL2的效应蛋白之一。                                   MG132（HY⁃13259）（上海 MCE 公司）；Lipofectamine
                  泛素化修饰是真核生物中蛋白修饰的一种重要                          3000转染试剂盒（L3000150）（ThermoFisher公司，美
              方式，80%~90%的蛋白通过泛素化途径降解                ［10-11］ 。去  国 ）、X ⁃ tremeGENE siRNA Transfection Reagent
              泛素化是泛素化的逆向过程，通过去泛素化酶发挥                            （04476093001）（Roche 公司，瑞士）；定量PCR引物、
              作用，泛素化与去泛素化之间呈现出可逆的动态平                            过表达载体构建引物、截短体构建引物和点突变载体
              衡 ［12］ 。哺乳动物体内包含6个家族共约100种去泛                      构建引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，siR⁃
              素化酶，其中USP14是泛素特异性蛋白酶（ubiquitin⁃                   NA序列由上海吉玛公司合成。
              specific peptidase，USP）家族中唯一一个与蛋白酶体               1.2  方法
              可逆结合的去泛素化酶，由类泛素（ubiguitin⁃like，                   1.2.1 质粒转染
              UBL）结构域和催化（catalytic，CAT）结构域构成。                        过表达实验：转染前 1 天细胞种板，过夜培养，
              其中 UBL 结构域通过与蛋白酶体的 19S 亚基结合，                      第 2 天待细胞密度达到 70%~80%后，使用 Lipo⁃
              抑制蛋白酶体活性，从而使靶蛋白免于降解；而                             fectamine 3000转染试剂盒，用Opti转染试剂分别稀
              CAT 结构域主要发挥去泛素化作用，通过与泛素化                          释 Lipo3000、p3000 和质粒，分别静置 5 min，混合后
              蛋白结合，移除泛素链，使之不能被蛋白酶体识别                            再静置 20 min。将混合液加入细胞中，6 h 后换液，
              和降解，进而达到稳定蛋白表达的目的                  ［12-15］ 。此外，   48~72 h收集细胞，提取蛋白。
              USP14 在线粒体自噬、内质网应激、DNA 损伤修复                            siRNA 敲降实验：转染前1天细胞种板，过夜培
              以及炎症发生中具有重要作用              ［16-19］ 。目前已有关于        养，第 2 天待细胞密度达到 30%~50%后，使用 X⁃
              OSBP/ORP家族某些成员泛素化研究的报道                 ［20-21］ ，但  tremeGENE siRNA Transfection Reagent 试剂盒，用
              关于OSBPL2泛素化和去泛素化的研究尚未见报道，                         Opti 转染试剂稀释小干扰试剂和 siRNA，混合静置
              本研究将探索USP14调控OSBPL2去泛素化的作用                        15~20 min，将混合液加入到完全培养基中，24~48 h
              机制，为从OSBPL2泛素化与去泛素化修饰水平探索                         收集细胞提取RNA，48~72 h收集细胞提取蛋白。
              OSBPL2生物学功能提供理论依据和新思路。                            1.2.2 Co⁃IP试验
                                                                     293Ta 细胞共转目的质粒 48 h 后，加入 IP 裂解
              1  材料和方法
                                                                液提取蛋白，取 150 μL 为对照（Input），剩余裂解液
              1.1  材料                                           中加入 proteinA/G 和目标抗体原液，置于颠倒混匀
                  HeLa 细 胞 和 293Ta 细 胞 由 本 实 验 室 保 存 ；          器上摇晃过夜，第2天对样品进行洗脱之后，加入蛋
              pXJ40 载体由本实验室保存；E.coli DH5ɑ化学感受                   白Loading变性，金属浴100 ℃ 10 min，-20 ℃保存。
              态细胞（南京诺唯赞公司）；pCDNA3.1⁃3×HA⁃UBB、                   1.2.3 蛋白质免疫印迹
              pCDNA3.1⁃HA⁃K48、pCDNA3.1⁃HA⁃K63（武汉淼灵                   取培养细胞加入RIPA裂解液提取总蛋白，使用
              质粒平台）。                                            BCA 试剂进行蛋白定量。取等量的蛋白加入 10%
                  ANTI⁃FLAG M2 Affinity Gel（A2220，Sigma 公       SDS⁃PAGE电泳胶中，分离并转膜至硝酸纤维膜上。
                             ®
              司，美国）、Western 及 IP 细胞裂解液（P0013）、RIPA              5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，加入目标一抗稀释液4 ℃
              裂 解 液（P0013B）（杭 州 碧 云 天 公 司），GAPDH                孵育过夜。次日回收一抗，加入相应二抗室温孵育
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