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第42卷第6期 张洪都，王红顺，王天明，等. USP14调控OSBPL2蛋白去泛素化作用的实验研究［J］.
2022年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：759-767 ·761 ·

2 h。然后用ECL发光液孵育，凝胶成像系统曝光。 产物进行重组转化，将转化产物均匀涂布在相应抗
1.2.4 实时定量PCR 性的LB平板上，平板倒置于37 ℃培养箱中培养12~
TRIzol 提取细胞总 RNA，测定提取的 RNA 浓 16 h。挑板、摇菌，菌液送公司测序，比对测序结果，
度，取1 μg总RNA反转录成cDNA，然后进行实时荧 找出序列正确的菌斑，扩增保存菌液，用于后续实
光定量PCR（real⁃time quantitative PCR，qRT⁃PCR）检 验。USP14 过表达与截短体载体构建引物见表 2，
®
测。采用 20 μL 扩增体系：SYBR Green Master Mix 点突变载体构建引物见表 3。USP14⁃siRNA 序列：
（2×）10 μL，cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物 Forward⁃5′⁃GCCUCGCAGAGUUGAAAUATT⁃3′，Re⁃
0.5 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序如下：预变性 95 ℃ verse⁃5′⁃UAUUUCAACUCUGCGAGGCTT⁃3′。
5 min；变性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，共40个 1.2.6 泛素化信号检测及OSBPL2泛素化水平检测
循环，目标基因 CT 值使用 GAPDH 基因 CT 值校正。 泛素化信号检测：在细胞中过表达目的蛋白
引物序列见表1。 Flag⁃OSBPL2、Myc⁃USP14以及HA⁃Ub质粒，48~72 h
收取细胞RIPA 裂解液，提取蛋白，以标签定量目的
表1 实时定量PCR引物 蛋白，以GAPDH定量总体泛素化，Western blot检测
Table 1 Primers for qRT⁃RCR 目的蛋白泛素信号的改变。
引物名称 序列（5′→3′） OSBPL2泛素化水平检测：293Ta细胞中共转染
H⁃q⁃OSBPL2⁃F GAAGGATGAACGGAGAGGAAG
目的蛋白 Flag⁃OSBPL2、Myc⁃USP14 以及 HA⁃UBB、
H⁃q⁃OSBPL2⁃R TCTGTGCTATTTTGTGATTTTCCG
®
HA⁃K48 或者 HA⁃K63 质粒，使用 ANTI⁃FLAG M2
H⁃q⁃USP14⁃F ACTGCAGCCCTTAGAGATTTG
Affinity Gel 富集目的蛋白，以 Flag 标签定量目的蛋
H⁃q⁃USP14⁃R TGTCCTTGTTCACCTTTCTCG
白，检测目的蛋白的泛素化水平。
H⁃q⁃GAPDH⁃F ACATCGCTCAGACACCATG
H⁃q⁃GAPDH⁃R TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG 1.3 统计学方法
采用 GraphPad Prism 7.0 进行统计分析。两独
1.2.5 过表达质粒构建 立样本采取 t 检验，定量结果和灰度扫描等数据采
采用https：//www.uniprot.org/在线软件分别查询 用均数±标准差（x ± s）表示，P < 0.05 为差异有统计
USP14的UBL结构域和CAT结构域以及OSBPL2的 学意义。
ORD 结构域的氨基酸范围，采用 http：//plmd.bio⁃
2 结 果
cuckoo.org/在线数据库预测OSBPL2的泛素化位点，
在截短体和突变位点附近设计截短引物和点突变 2.1 OSBPL2与USP14的相互作用验证
引物，使用 Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2 试 外源性过表达和 Co⁃IP 实验结果显示，OSBPL2
剂盒进行目的片段的扩增和消化，然后切胶回收， 与 USP14 之间存在相互作用（图 1A）。通过构建

表2 USP14过表达与截短体载体构建引物
Table 2 Primers for USP14⁃overexpression and truncated vector
引物名称 序列（5′→3′）

pXJ40⁃Flag⁃USP14⁃F ACGATGATAAGTCCggatccATGCCGCTCTACTCCGTTACT
pXJ40⁃Flag⁃USP14⁃R CTTTAATAAGATCTggtaccTTACTGTTCACTTTCCTCTTC
pXJ40⁃Myc⁃USP14⁃F TTGCGGAAACATATGggatccGAGACCCTCACGGAGCTGGGCG
pXJ40⁃Myc⁃USP14⁃R TTTAATAAGATCTggtaccTTACTGTTCACTTTCCTCTTC
pXJ40⁃HA⁃USP14⁃F CCAGACTACGCAggatccATGCCGCTCTACTCCGTTACT
pXJ40⁃HA⁃USP14⁃R CTTTAATAAGATCTggtaccTTACTGTTCACTTTCCTCTTC
pXJ40⁃HA⁃∆CAT⁃F TGCCAGACTACGCAggatccATGCAGATCTTCGTCAAGACG
pXJ40⁃HA⁃∆CAT⁃R CTTTAATAAGATCTggtaccTTATTCTACGAAGACAGTTTTGGC
pXJ40⁃Flag⁃∆FFAT⁃F GACGATGATAAGTCCggatccAGCGTGTGGACCATCCTGAA
pXJ40⁃Flag⁃∆FFAT⁃R CTTTAATAAGATCTggtaccTCAGTAGATATCTGGGCAGT
pXJ40⁃HA⁃∆UBL⁃F TGCCAGACTACGCAggatccGACATGACAGAAGAACAGTTA
pXJ40⁃HA⁃∆UBL⁃R CTTTAATAAGATCTggtaccTTACTGTTCACTTTCCTCTTC
加粗字体表示同源重组连接的同源臂，加粗小写字体表示KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点。