Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第6期
·762 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月

表3 突变体载体构建引物
Table 3 Primers for mutant vector
引物名称 序列（5′→3′）

pXJ40⁃HA⁃USP14 W58A⁃F GGATGATGATgcaGGAAACATCAAAATAAAAAATGGAAT
pXJ40⁃HA⁃USP14 W58A⁃R TTCCtgcATCATCATCCTTTAGCGTTCCTCCT
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K81A⁃F CATCCTGgctAAGTGTGTTGGCCTGGAGCTGT
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K81A⁃R CACACTTagcCAGGATGGTCCACACGCTGAAG
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K209A⁃F AAGTTCTGGGGCgcgAGCGTGGAGGCGGAGCCC
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K209A⁃R CTcgcGCCCCAGAACTTGAGCTTGGGGTAGAT
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K361A⁃F ATTCCTGGCAGCgccCTGCTCTGGAGGATCAACACCC
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K361A⁃R AGggcGCTGCCAGGAATGACCTGCACGGTCTC
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K423A⁃F CAGGAGgccGAGCGGCTGGAGGAGAAGCAGAG
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K423A⁃R AGCCGCTCggcCTCCTGGCTGGCCAGATCCAT
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K439A⁃F CgccGAGGAGGCAGAGTGGCAGACGAGGTGGT
pXJ40⁃Flag⁃OSBPL2 K439A⁃R ACTCTGCCTCCTCggcGGCCCGCTCCCTCCGTGC
黑色小写加粗字体表示点突变的碱基。

Flag⁃OSBPL2 和 HA⁃USP14 的截短蛋白（图 1B）进一 变，OSBPL2的表达量降低，并且有剂量依赖趋势（图
步阐明两者互作的关键结构域，Co⁃IP 检测结果发 2C）。用CHX处理过表达USP14的细胞，OSBPL2蛋
现，USP14 的 CAT 结构域与 OSBPL2 的 ORD 结构域 白的周转速率降低（图 2D）。综合以上结果说明，
存在相互作用关系，而UBL结构域不与ORD结构域 USP14 通过与 OSBPL2 相互作用参与 OSBPL2 的翻
相互作用（图 1C）。这一结果提示，CAT 是 OSBPL2 译后修饰过程，从而稳定OSBPL2蛋白的表达。
与USP14互作的关键结构域。 2.3 USP14 通过抑制 OSBPL2 的 K48 泛素链降低
2.2 USP14参与OSBPL2的翻译后修饰过程 OSBPL2的泛素化水平
过表达 USP14 的 HeLa 细胞中 OSBPL2 的蛋白 体外过表达实验的结果表明USP14能够识别并
水平增加，而转录水平没有改变（图 2A）。敲降 切割多泛素基团，尤其是Ub4⁃8泛素基团的信号明显减
USP14 的 HeLa 细胞中 OSBPL2 的蛋白表达水平降 弱（图3A）。采用Anti⁃Flag富集OSBPL2，Western blot
低，而转录水平并未改变（图2B）。采用USP14活性 检测结果显示USP14可以明显降低OSBPL2的泛素
抑制剂 IU1 处理细胞之后，USP14 表达量并没有改 化水平（图3B）。进一步探究USP14抑制的泛素链类

A C
IP IP Flag⁃OSBPL2 + + - + - - -
-
HA⁃USP14
- -
Anti⁃Flag
5%Input Normal IgG 5%Input Normal IgG Anti⁃USP14 HA⁃△CAT + - - - + - +
-
- +
HA⁃△UBL
Flag⁃△FFAT - - + + +
HA 55 kDa OSBPL2 55 kDa
Flag 56 kDa USP14 56 kDa Flag
Input
B C
OSBPL2
FFAT ORD HA
1 57 480
57 △FFAT 480
Anti⁃Flag
3 80
USP14
UBL CAT
IP
1 91 Anti⁃HA
1 △CAT 90
91 △UBL 494
A：Co⁃IP验证外源性与内源性USP14与OSBPL2的相互作用；B：OSBPL2与USP14蛋白截短示意图；C：免疫共沉淀验证USP14的CAT结构
域与OSBPL2的ORD结构域的相互作用关系。
图1 OSBPL2与USP14的相互作用验证以及关键结构域
Figure 1 Interaction between USP14 and OSBPL2 and the key interactional domains