Page 12 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第6期
·764 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月

A B
Flag⁃OSBPL2 - + + Myc⁃USP14 - - - + - - - +
Myc⁃USP14 - - + Flag⁃OSBPL2 - - + + - - + +
HA⁃UBB + + + HA⁃UBB - + + + - + + +
—150 kDa
—100 kDa
Ub4-8
—70 kDa
IB：HA HA
—50 kDa
—40 kDa IB：
Ub3
Ub2
—35 kDa
Ub1
—25 kDa
—20 kDa
—15 kDa
Flag 55 kDa
GAPDH 37 kDa
IP：Flag Input
Flag 55 kDa
C D
HA⁃K48 + + + + + + HA⁃K63 + + + + + +
Flag⁃OSBPL2 - + + - + + Flag⁃OSBPL2 - + + - + +
Myc⁃USP14 - - + - - + Myc⁃USP14 - - + - - +
IB：HA
IB：HA

Flag 55 kDa Flag 55 kDa
IP：Flag Input IP：Flag Input
A：同时过表达Flag⁃OSBPL2、Myc⁃USP14和HA⁃UBB，Western blot检测OSBPL2的泛素化信号Ubn；B：体外过表达Flag⁃OSBPL2、HA⁃UBB和
Myc⁃USP14，Flag 抗体富集 Flag⁃OSBPL2，Western blot 检测 OSBPL2 的泛素化水平；C：HEK293Ta 细胞中共转染 HA⁃K48、Myc⁃USP14 和 Flag⁃
OSBPL2，Flag 抗体免疫沉淀 Flag⁃OSBPL2，Western blot 检测 OSBPL2 的 K48 链泛素化水平；D：HEK293Ta 细胞中共转染 HA⁃K48、Flag⁃OSBPL2
和Myc⁃USP14，Flag抗体免疫沉淀Flag⁃OSBPL2，Western blot检测OSBPL2的K63链泛素化水平。
图3 USP14通过抑制OSBPL2的K48链泛素化降低OSBPL2的泛素化水平
Figure 3 USP14 reduced the ubiquitination level of OSBPL2 by inhibiting K48 ubiquitin chain of OSBPL2

A B
IP：Flag Input IP：Flag Input
Empty vector + - - + - - Empty vector + - - + - -
Flag⁃USP14 - + + - + + Flag⁃USP14 - + - - + -
Lactacystin - - + - - + Flag⁃W58A⁃USP14 - - + - - +
PSMD2 100 kDa PSMD2 100 kDa
Flag 56 kDa Flag 56 kDa
C D
IP：Flag Input IP：Flag Input
Empty vector + - - + - - Empty vector - - - - - - - -
Flag⁃USP14 - + - - + - HA⁃WT⁃USP14 + + + - + + + -
Flag⁃W58A⁃USP14 - - + - - + HA⁃W58A⁃USP14 - - - + - - - +
Flag⁃OSBPL2 - + + + - + + +
OSBPL2 55 kDa
MG132 - + - - - + - -
Flag 56 kDa Flag 55 kDa
HA 56 kDa
A：乳胞素（10 μmol/L）处理转染Flag⁃USP14的HeLa细胞12 h，Flag抗体富集Flag⁃OSBPL2，Western blot检测PSMD2；B：UBL结构域突变型
质粒转染 HeLa 细胞，Flag 抗体富集 Flag⁃OSBPL2，Western blot 检测 PSMD2；C：HeLa 细胞中分别转染野生型 USP14 质粒和 UBL 结构域突变型
USP14 质粒，以 Flag 作为 IP，Western blot 检测 OSBPL2 与 USP14 结合的强弱；D：HeLa 细胞中分别转染野生型 USP14 质粒（HA⁃WT⁃USP14）和
UBL结构域突变型USP14质粒（HA⁃W58A⁃USP14），并以MG132处理细胞，以Flag作为IP，Western blot检测OSBPL2与USP14结合的强弱。
图4 蛋白酶体抑制或UBL结构域突变诱导USP14与OSBPL2互作增强
Figure 4 Proteasome inhibition or UBL domain mutation induced enhanced⁃interaction between USP14 and OSBPL2

突变致聋的分子发病机制迄今仍未阐明。该基因 类重要的固醇感受器，参与了脂质代谢与转运、囊
编码的蛋白属于 OSBP/ORP 家族成员，ORP 作为一 泡运输和信号转导等过程 ［1-2］ 。此外，研究发现一些