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第42卷第6期 张洪都，王红顺，王天明，等. USP14调控OSBPL2蛋白去泛素化作用的实验研究［J］.
2022年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：759-767 ·763 ·

A HA HA⁃USP14 2.0 1.5 *
OSBPL2 mRNA 相对表达量 1.0 1.0
OSBPL2 56 kDa 1.5 （ /GAPDH）
GAPDH 37 kDa 0.5 OSBPL2蛋白表达相 0.5

0 对灰度值
HA HA⁃USP14 0
HA HA⁃USP14
B C
siRNA NC siUSP14 1.5
OSBPL2 mRNA 相对表达量 OSBPL2 55 kDa
OSBPL2 55 kDa 1.0 IU1（μmol/L） 0 50 100
USP14 56 kDa
GAPDH 37 kDa 0.5 USP14 56 kDa
0
NC siUSP14
GAPDH 37 kDa
D
OSBPL2蛋白表达相
HA HA⁃USP14 2.0 ** HA
0 h 2 h 4 h 8 h 0 h 2 h 4 h 8 h （ /GAPDH） 1.5 ** HA⁃USP14
OSBPL2 55 kDa **
37 kDa 0.5 *
GAPDH 对灰度值 1.0
0
0 h 2 h 4 h 8 h
A：过表达HA⁃USP14的HeLa细胞中OSBPL2的蛋白表达和转录水平，两组比较，P＜0.05；B：敲降USP14的HeLa细胞中OSBPL2的蛋白表
*
达和转录水平；C：USP14 抑制剂 IU1 处理，HeLa 细胞中 OSBPL2 的蛋白表达。D：50 μg/mL CHX 处理过表达 HA⁃USP14 的 HeLa 细胞，Western
blot检测OSBPL2蛋白的周转速率,两组比较，P＜0.05，P＜0.01。
**
*
图2 USP14参与OSBPL2的翻译后修饰过程
Figure 2 USP14 involved in the post⁃translational modification of OSBPL2

型可知，USP14抑制了OSBPL2偶联的K48链泛素化 照组相比，USP14 与 OSBPL2 的相互作用也有所增
水平（图3C）而不影响K63链泛素化水平（图3D）。综 强，趋势与 UBL 结构域突变之后的结果一致（图
合以上结果说明，USP14通过抑制OSBPL2的K48链 4D）。综合以上结果可知，当抑制蛋白酶体活性或者
泛素化进而调控OSBPL2的泛素化水平。 突变UBL结构域之后，都会导致USP14与OSBPL2相
2.4 蛋白酶体抑制或 UBL 结构域突变诱导 USP14 互作用增强，进而稳定OSBPL2蛋白的表达。
与OSBPL2互作增强 2.5 Lys209 和 Lys361 位点参与 OSBPL2 去泛素化
UBL 结构域是 USP14 的另一个结构域，介导 调控
USP14 与蛋白酶体的结合。乳胞素（Lactacysin）是 为了进一步探究 OSBPL2 上 K48 泛素链可能的
一种蛋白酶体抑制剂，可以特异性不可逆地从蛋白 连接位点，通过蛋白质赖氨酸修饰数据库（Protein⁃
酶体上解离USP14。在乳胞素处理的HeLa细胞中， Lysine Modifications Database，PLMD，http：//plmd.
USP14与非ATP酶蛋白酶体26S亚基2（PSMD2）的相 biocuckoo.org/）预测，提示 OSBPL2 有 5 个泛素化位
互作用明显减弱（图4A）。UBL结构域中第54~60位 点且都在ORD结构域中（表4）。根据预测结果，构建
的氨基酸高度保守，所以将第58位的色氨酸突变为 5个位点的突变质粒（图5A）。Co⁃IP检测结果发现，
丙氨酸（W58A），构建UBL结构域突变的质粒，以模 当 Lys209 和 Lys361 位点突变后，OSBPL2 与 USP14
拟乳胞素抑制蛋白酶体的效果，Co⁃IP 检测结果显 的相互作用减弱（图 5B、C），OSBPL2 的泛素化水平
示，USP14 与 PSMD2 的结合明显减弱（图 4B），与乳 未受影响（图 5D）。此结果说明 OSBPL2 的 Lys209
胞素处理所得结果相同，进一步确定了USP14通过 和 Lys361 很可能是 K48 泛素链连接 OSBPL2 并被
UBL 结构域与蛋白酶体相结合。HeLa 细胞转染过 USP14去泛素化修饰的关键位点。

表达野生型USP14质粒和UBL结构域突变的USP14 3 讨 论
质粒，Co⁃IP 检测结果表明，当 USP14 的 UBL 结构域
突变之后，USP14 与 OSBPL2 的结合会明显增强（图 本课题组在国际上最先定位和克隆了人常染色
4C）。当加入 MG132 抑制蛋白酶体活性之后，与对 体显性遗传性耳聋的致病基因 OSBPL2，但 OSBPL2