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第42卷第7期        祁颜艳，顾 愹，杨       涛. 负载HIP的耐受性树突状细胞对BDC2.5 T细胞的免疫调节作用［J］.
                  2022年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：913-920                        ·915 ·


                4 组 DC 计数并按 1×10 个/mL 铺板，向 LPS⁃tolDC 组            未染CFSE的T细胞用APC⁃CD4、FITC⁃CD44、PE/cy⁃
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                以及 LPS⁃iDC 组加入 LPS（1 μg/mL）刺激 24 h，然后             anine7⁃CD69、BV421⁃CD25 流式抗体先进行细胞表
                进行下一步表型鉴定及功能试验。                                   面染色并避光孵育 30 min，洗涤后用 Foxp3 转录因
                1.2.2  DC的表型鉴定                                    子染色试剂盒进行破核处理，用PE⁃Foxp3进行染色
                    在 DC 培养的第 8 天收集部分 iDC、tolDC 以及                并避光孵育30 min，洗涤后用流式细胞仪检测。
                用 LPS 刺激后的 LPS⁃tolDC、LPS⁃iDC，显微镜下观                1.3  统计学方法
                察其形态后 1 500 r/min 离心 5 min，收集其上清液                     本研究应用 FlowJo 10.4 进行流式数据的分析，
                于-80 ℃保存，后续用 ELISA 做细胞因子检测。收                      Graphpad Prism 9 进行绘图及统计学分析。正态分
                集的DC用PBS洗涤后调整至1×10 个/100 μL，置于                    布数据用均数±标准差（x ± s）表示，两组定量资料的
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                流式管中，加入流式抗体 FITC⁃CD11c、PE⁃CD80、                   比较采用 t 检验（符合正态性和方差齐性），多组定
                Percp⁃cy5.5⁃CD86、APC⁃MHCⅡ、APC⁃PD⁃L1，避光            量资料组间差异比较用单因素方差分析（one⁃way

                4 ℃孵育 30 min 后加入 4 mL PBS 洗涤，1 500 r/min          ANOVA）检验，多组间的两两比较应用 LSD 检验。
                离心 5 min，200 μL PBS 重悬，流式细胞仪检测，对                  P < 0.05时差异有统计学意义。
                各组DC进行纯度及表型鉴定。
                1.2.3  BDC2.5 TCR转基因小鼠脾脏细胞的获取                     2 结    果

                    BDC2.5 T 细胞克隆过继转移给未发病的 NOD                    2.1  1α，25-二羟基维生素 D3 诱导的 tolDC 具有稳
                鼠或者 NOD⁃SCID 鼠都会迅速导致糖尿病的发生，                       定的耐受表型
                目前被广泛应用在糖尿病相关研究中。本研究采                                 显微镜下观察培养第 8 天的 DC 可见：由 GM⁃
                用来自BDC2.5 TCR转基因鼠的BDC2.5 T细胞作为                    CSF、IL⁃4 诱导的 iDC 呈圆球形，表面可见树突状结
                研究对象。准备 1 个装有 200 目滤膜的培养皿，加                       构伸出，LPS可以通过DC膜上的Toll样受体刺激其
                入 5 mL 美天旎 autoMACS Runnning Buffer 并置于冰          成为 LPS⁃iDC（mDC），其表面树突状结构更加明显
                上，选择6~13周龄的BDC2.5 TCR转基因小鼠，麻醉                     且倾向聚集形成集落。在培养基中额外加入VitD3
                后颈椎脱臼处死，取其脾脏细胞，置于培养皿中，再                           可诱导出纺锤形的 tolDC，LPS 刺激后其形态如
                覆上1张滤膜，用5 mL注射器的尾部进行研磨获得                          图 1A 所示。用流式细胞术检测 DC 表面的 CD11c
                单细胞悬液，将脾脏细胞离心后裂红处理，Buffer洗                        分子进行纯度鉴定，结果显示培养 8 d 的 iDC 纯度
                涤后用滤膜过滤，最终进行计数。按照说明书用                             可达80%~90%左右，且tolDC的纯度更高，多达90%
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                CD4 T细胞阴选磁珠分选出CD4 T细胞，在96孔U                       以上（图1B）。
                型底培养板中按每 100 μL 培养基中 2.5×10 个 T 细                     进一步对 DC 的表面分子进行流式检测（图
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                胞每孔进行铺板。需进行细胞增殖实验的T细胞在                            2A~D），结果显示 tolDC 的 CD80、CD86 分子表达明
                铺板前用 CFSE 染色：CFSE 储存液用 PBS 稀释至                    显 低 于 iDC（平 均 荧 光 强 度 CD80：172.3 ± 7.8 vs.
                2.5 μmol/L，1 mL 的 CSFE 稀释液可染至多 1×10 个             277.8±61.2，CD86：36.4±3.9vs.87.8±31.4，P均<0.05）。
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                T细胞，染色后置于37 ℃培养箱中避光孵育3~4 min，                     tolDC 的 MHCⅡ分子表达低于 iDC 但没有统计学
                然后用10 mL的RPMI1640完全培养基终止反应，洗                      差异，但在 LPS 刺激 24 h 后，LPS⁃tolDC 的 CD80、
                涤后同上述步骤进行计数铺板。                                    CD86 及 MHCⅡ 分 子 表 达 均 明 显 低 于 LPS⁃iDC
                1.2.4  DC与T细胞的共培养                                （P 均 < 0.01）。tolDC 表面的 PD⁃L1 分子表达显著
                    在DC培养的第8天将2.5HIP（1 μg/mL）分别加                  高于iDC（平均荧光强度：363.3±33.0 vs. 126.2±18.0，
                入 iDC、tolDC、LPS⁃tolDC、LPS⁃iDC 组共孵育 4 h（对          P < 0.001），且LPS刺激24 h后仍高于LPS⁃iDC（平均
                照组加入乙型肝炎病毒抗原肽作为无关肽共孵育                             荧光强度：1 389.0±348.2 vs. 738.8±32.9，P < 0.05）。
                4 h）。用PBS 洗涤后计数，按照1∶10与上述获得的                      分别检测 LPS 刺激后的 tolDC 和 iDC 细胞因子分泌
                T 细胞共培养，即每孔 2.5×10 个 DC、2.5×10 个 T 细              情况，发现 tolDC 分泌的炎症细胞因子 IL⁃12p70 显
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                胞。共培养72 h后，用流式细胞术检测CD4 T细胞                        著下降［（49.1±3.0）pg/mL vs.（127.7 ± 7.4）pg/mL，
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                的增殖、活化情况以及诱导Treg生成的情况。染有                          P < 0.001］，而具有免疫抑制作用的 TGF⁃β细胞因
                CFSE的CD4 T细胞用APC⁃CD4流式抗体进行染色                      子则 明 显 升 高［（970.7±109.9）pg/mL vs.（747.9±
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                并避光孵育 30 min，洗涤后流式细胞仪进行检测。                        48.6）pg/mL，P < 0.05，图2E、F］。
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