Page 18 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 18

第42卷第7期
               ·914 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年7月


              核 心 作 用 ，诱 导 胰 岛 自 身 抗 原 耐 受 有 望 治 愈              探究负载2.5HIP的tolDC对致糖尿病性BDC2.5 T细
              T1DM。但目前不管是针对胰岛自身抗原如胰岛                            胞的免疫调节作用。
              素、谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），
                                                                1 材料和方法
              还是针对一些致病表位肽如胰岛素B9⁃23、DiaPep277
              等的抗原特异性免疫耐受治疗，均未达到理想的效                            1.1  材料
              果，这主要由于自身反应性 T 细胞识别的表位仍未                               实验动物均为SPF级别，实验所用的8~12周龄
              完全明确 。越来越多的证据表明，免疫系统对β细                           NOD 雌鼠、6~13 周龄 BDC2.5 TCR 转基因雌鼠均来
                      ［1］
              胞的攻击很可能是由于β细胞受到应激或病毒感染                            自南京大学模型动物研究中心。实验动物的饲
              从而产生新生抗原或表位引起的                  ［2- 4］ ，新表位在      养、使用及处理均经过南京医科大学实验动物伦
              T1DM 发病机制中可能发挥重要作用               ［5-6］ ，它的产生      理委员会审批（批准编号：IACUC⁃2011058）。实验
              解释了为何自身反应性T细胞能逃脱胸腺的阴性选                            所用的试剂包括：RPMI1640培养基、胎牛血清（fetal
              择来攻击β细胞。美国的 Kathryn 教授利用致糖尿                       bovine serum，FBS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer
              病性BDC CD4 T细胞克隆系来识别β细胞蛋白提取                        saline，PBS）（Gibco 公司，美国）；粒细胞集落刺激因
                           +
              物，发现了一种由胰岛素与β细胞分泌颗粒内其他                            子（granulocyte⁃macrophage colony⁃stimulating factor，
              抗原共价交联剪切融合而成的新表位多肽，将其命                            GM⁃CSF）、白介素（interleukin，IL）⁃4（Peprotech 公
                                            ［7］
              名为“hybrid insulin peptide（HIP）” 。在 T1DM 患者        司，美国）；1α，25⁃二羟基维生素 D3（VitD3）、脂多
              和动物模型NOD（non⁃obese diabetic）小鼠体内均存在               糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma 公 司 ，美 国）；
              识别这种致病性表位的自身反应性CD4 T细胞                    ［8-9］ 。  CellTrace CFSE 细胞增殖试剂（Invitrogen 公司，美
                                                  +
              基于这种新表位诱导抗原特异性免疫耐受为T1DM                           国）；小鼠 IL⁃12p70 细胞因子检测试剂盒（R&D 公
              的治疗提供了新的研究方向 。                                    司 ，美 国）；小 鼠 转 化 生 长 因 子 ⁃ β（transforming
                                       ［6］
                  树突状细胞（dendritic cell，DC）作为强大的专                growth factor⁃β，TGF⁃β）细胞因子检测试剂盒（深圳
              职抗原提呈细胞，不仅可以诱导免疫反应发生，而                            欣博盛）；2.5HIP 序列 EVEDPQVAQLELGGGPGAG⁃
              且在诱导中枢和外周耐受、维持免疫稳态中也发挥                            DLQTLALWSRMDQL⁃AKELTAE（上海吉尔生化公
              着重要作用      ［10］ 。一方面，在经典免疫反应中，外周                  司合成）；小鼠 CD4 T 细胞阴选磁珠、autoMACS
                                                                                   +
              未成熟 DC（imature DC，iDC）在遇到抗原和危险信                   Runnning Buffer（美天旎公司，德国）。实验中所用
              号后上调共刺激分子（CD80、CD86、CD40 等）、主要                    的流式抗体包括：FITC⁃CD11c、PE⁃CD80、Percp⁃
              组织相容性复合体（major histocompatibility complex，        cy5.5⁃CD86、APC⁃MHCⅡ、APC⁃PD⁃L1、APC⁃CD4、
              MHC）分子和促炎细胞因子、趋化因子的表达，成为                          FITC⁃CD44、PE/cyanine7⁃CD69、BV421⁃CD25、PE⁃
              成熟的 DC（mature DC，mDC）从而能够迁移到淋巴                    Foxp3 均来自美国 Biolegend 公司；流式细胞术所用
              结并诱导免疫反应发生；另一方面，还存在着一群                            破 核 试 剂 eBioscience TM  FOXP3/Transcription Factor
              耐受性 DC（tolerogenic DC，tolDC）通过低表达共刺               Staining Buffer Set（Invitrogen公司，美国）。
              激分子、高表达共抑制分子、分泌抗炎细胞因子等                            1.2  方法
              机制诱导 T 细胞克隆失能、凋亡等。因此，tolDC 作                      1.2.1  小鼠骨髓来源的DC培养
              为一种细胞疗法在自身免疫疾病包括T1DM的治疗                                取 8~12 周龄的 NOD 雌鼠，分离其肱骨、胫骨，
              中富有前景      ［11-13］ 。然而目前 tolDC 在 T1DM 方面的         75%酒精消毒5 min后用PBS冲洗去除两端骨骺，用
              研究主要是非抗原特异性或是仅针对单一抗原                              1 mL注射器冲洗骨髓腔内的骨髓细胞至RPMI1640
                                          ［14］
             （GAD）或抗原肽（胰岛素原肽） ，而表位扩展等原                          完全培养基中，裂红处理后用 200 目的滤网过滤
              因产生的新表位如2.5HIP可能在T1DM发病机制中                        并洗涤，每只鼠大概可以获得 2×10 ~4×10 个骨髓
                                                                                                       7
                                                                                                 7
              发挥了重要作用。2.5HIP是由胰岛素原的C肽片段                         细胞，计数后用 RPMI1640 完全培养基重悬并调
             （LQTLAL）与嗜铬粒蛋白A的WE14片段（WSRMD）                      整密度至 1×10 个/mL。实验设置 iDC 组、tolDC 组、
                                                                              6
              融合形成的杂交肽，它是NOD小鼠体内分离出来的                           LPS⁃tolDC 组、LPS⁃iDC 组（即 mDC 组），每组均加入
              致糖尿病性的 T 细胞克隆系 BDC2.5 T 细胞             ［15］ 特异    GM⁃CSF 20 ng/mL 和 IL⁃4 10 ng/mL，tolDC 及 LPS⁃
              性识别的抗原表位 。针对2.5HIP诱导抗原特异性                         tolDC 组额外加入 VitD3（1×10 mol/L）于 6 孔板中
                               ［7］
                                                                                            -8
              免疫耐受是 T1DM 治疗的新思路，所以本研究旨在                         培养，每隔 2~3 d 进行换液，于培养的第 7 天收集
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23