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第42卷第7期          张潇月，郑 月，蒋       厅，等. ALCAT1缺失在KRAS诱导肺腺癌中的作用及机制研究［J］.
                  2022年7月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：932-940，972                     ·933 ·


                    目前在全球范围内，肺癌仍然是导致癌症死亡                          非小细胞肺癌中显著上调，利用 ALCAT1 模拟肽阻
                          ［1］
                的主要原因 。肺癌患者中约 80%为非小细胞肺                           断 ALCAT1 活性可影响非小细胞肺癌的迁移                   ［20］ 。
                癌，其中肺腺癌是非小细胞肺癌最常见的亚型 。                            本研究通过构建 CC10rtta⁃KRAS/ALCAT1 KO 转基
                                                           ［2］
                在肺腺癌中 Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物                        因 小 鼠 模 型 ，初 步 发 现 ALCAT1 基 因 缺 失 减 缓
               （Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）  KRAS 诱导肺腺癌的发展，并发现在A549细胞中抑
                                           ［3］
                第 12 号密码子经常发生突变 。突变的 KRAS 通                       制 ALCAT1 可阻止 ROS 产生，降低 HIF1α表达，从
                过调节 Raf/Erk 和 PI3K/Akt 信号通路促进肺腺癌的                 而抑制糖酵解代谢产物，并影响 Akt 磷酸化水平，
                    ［4］
                发生 ，并导致高度活跃的糖酵解和氧化应激增                             为进一步研究 ALCAT1 缺失或抑制在肺腺癌中的
                  ［5］
                加 。到目前为止，KRAS 突变的肺腺癌没有有效                          作用与机制奠定了基础。
                的治疗方法。
                    肿瘤缺氧微环境导致癌细胞代谢异常和快速增                          1 材料和方法
                殖 。肿瘤代谢异常会激活PI3K/Akt信号通路，该通                       1.1  材料
                 ［6］
                路通过关键转录因子缺氧诱导因子 1α（hypoxia⁃                           人肺腺癌细胞系（A549）购自中国科学院生物化
                inducible factor 1 alpha，HIF1α）调节糖酵解，并降低          学与细胞生物学研究所；CC10rtta⁃KRAS小鼠来自清
                线粒体功能      ［7-8］ 。线粒体功能障碍会导致活性氧                   华大学，ALCAT1 KO 小鼠由本实验室前期构建                 ［17］ ，
               （reactive oxygen species，ROS）增加，研究发现增加             在南京医科大学实验动物基地的 SPF 环境中饲养，
                                         ［9］
                ROS水平可促进癌细胞转移 。此外肿瘤中ROS增                          研究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批
                加可以激活 PI3K/Akt 通路调节 HIF1α的转录，从                    准，批文编号：IACUC⁃1601272⁃1。4%多聚甲醛（武
                而促进氧化磷酸化到糖酵解的转变                  ［10］ ，并且 ROS     汉塞维尔生物公司），GAPDH、HIF1α、p⁃Akt（T308）、
                对 KRAS 诱导肺腺癌的发生发展至关重要                   ［11］ ，但   Akt、Erk1/2、p⁃Erk1/2 抗体（Cell Signaling Technology
                ROS 在 KRAS 诱导的肺腺癌中的调节机制尚未完                        公司，美国），ECL 显影液（Thermo Fisher 公司，美
                全清楚。                                              国），HiScriptⅡ Q RT SuperMix、ChamQ SYBR qPCR
                    心磷脂（cardilipin，CL）是一种线粒体标志性磷                  Master Mix（南京诺维赞公司），引物由上海杰瑞公
                脂，主要存在于线粒体内膜中，在线粒体功能中发                            司合成，HE 染色试剂（北京索莱宝科技公司），
                挥重要作用，包括电子传递、线粒体动力学、线粒                            ROS 检测试剂盒（上海碧云天科技公司），乳酸检测
                体生物发生、凋亡机制和血管发育                 ［12］ 。CL 酰基链      试剂盒（南京建成生物公司），多西环素饲料（北京
                结构决定其功能，在正常组织中以亚油酸（C18∶2）                         凯 国 科 技 有 限 公 司），Jenuglitapin（Jenu，Perenna
                为主。衰老引起心磷脂的病态重构，导致亚油酸                             Pharmaceuticals公司，美国），Mito Q（MedChem Express
               （C18∶2）逐渐被二十二碳六烯酸（docosahexaenoic                  公司，美国）。
                acid，DHA，C22∶6）所取代，DHA 富含双键使得 CL                  1.2  方法
                对 ROS 的氧化损伤高度敏感，氧化的 CL 导致线                        1.2.1  动物分组和处理
                粒体功能障碍和各种衰老相关疾病                   ［13］ 。研究发           将 ALCAT1 KO 小鼠与 CC10rtta⁃KRAS 小鼠杂
                现在 C6 神经胶质瘤细胞中 CL 酰基链改变导致能                        交，最终产生CC10rtta⁃KRAS/ALCAT1 KO小鼠，对照
                量代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解                  ［14］ 。此外 CL      组为 CC10rtta⁃KRAS 小鼠。8 周龄 CC10rtta⁃KRAS/
                分子种类异常与胶质瘤细胞和甲状腺癌细胞增                              ALCAT1 KO、CC10rtta⁃KRAS 雄性小鼠随机分为正
                殖相关   ［15-16］ 。                                   常饮食组（n=3）及多西环素饮食组（n=6）。分别在

                    心磷脂酰基转移酶 1（cardiolipin acyltransferase        多西环素饮食 8 周、12 周通过小动物 CT 观察肺部
                1，ALCAT1）是一种酰基转移酶，通过催化溶血 CL                       肿瘤，在实验终点多西环素饮食 12 周时解剖取
                再酰化为CL，导致CL 酰基链DHA 含量增加                ［17］ 。本    肺组织。
                实验室前期工作发现在各种衰老相关代谢疾病中                             1.2.2  基因型鉴定

                ALCAT1 高表达并导致线粒体功能障碍。ALCAT1                           从小鼠脚趾中提取DNA，利用Rapid Taq master
                基因缺失通过阻止ROS产生恢复线粒体呼吸，并预                           mix、引物、双蒸水配制 PCR 体系，进行目的片段扩
                防各种与年龄相关疾病的发生，包括神经退行性疾                            增。根据电泳结果，确定其基因型以筛选出符合要
                病 ［18］ 和心血管疾病   ［19］ 等。研究发现ALCAT1在人类              求的小鼠。PCR 扩增引物序列：NEO 正向引物 5′⁃
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