Page 38 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第7期
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              AGGATCTCCTGTCATTCTACCTTGCTC⁃ 3′，反向引               检测基因表达，PCR 程序如下：95 ℃预变性 5 min，
              物5′⁃AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG⁃               95 ℃变性 30 s，60 ℃退火延伸 60 s，95 ℃ 1 min，循
              3′；ALCAT1正向引物5′⁃GCCCTCATCAGCACTCAG⁃               环 40 次。GAPDH 用作 mRNA 内部标准化对照。
              TA⁃3′，反向引物 5′⁃AAAACACAAAATGGATATG⁃                RT⁃PCR 扩增引物包括以下序列：TTF1 正向引物
              CAGAA⁃3′；CC10rtta 正向引物 5′⁃AAAATCTTGC⁃             5′ ⁃ AAAACTGCGGGGATCTGAG ⁃ 3′ ，反 向 引 物 5′ ⁃
              CAGCTTTCCCC ⁃ 3′ ，反 向 引 物 5′ ⁃ ACTGCCCATT⁃        TGCTTTGGACTCATCGACAT⁃3′；GAPDH 正向引物
              GCCCAAACAC ⁃ 3′ ；KRAS 正 向 引 物 5′ ⁃ AGAC ⁃         5′⁃AATGGTGAAGGTCGGTGTG⁃3′，反向引物5′⁃GT⁃
              ACAAAACAGGCTCAGGA⁃3′，反向引物 5′⁃GGAGA⁃               GGAGTCATACTGGAACATGTAG⁃3′。
              CAATGGTTGTCAACAGA⁃3′。                             1.2.7  细胞培养
              1.2.3  微计算机断层扫描技术                                      A549 细胞使用 DMEM 高糖培养基培养，并在

                  使用微计算机断层扫描技术（micro⁃computed                   培养基中加入 10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉
              tomography，micro⁃CT）观察小鼠肺部肿瘤。正式扫                  素和 100 mg/mL 链霉素，放在 37 ℃、5% CO2培养箱
              描标本前，先扫描标准模体，进行 CT 值校正。使用                         中培养。
              2%异氟烷，98%氧气条件下对小鼠进行麻醉，选择                          1.2.8  乳酸检测
              胸腔视野进行扫描，调节参数。每只小鼠扫描时间                                 将 A549 细胞接种到 6 孔板，分为 4 组：对照组、

              约 20 min。扫描完成后，使用 IRW（Inveon research             Jenu 组、缺氧组、缺氧+Jenu 组，CoCl2 200 μmol/L 诱
              workplace）软件进行图像分析。                               导缺氧，Jenu 10 μmol/L 抑制 ALCAT1，共处理细胞
              1.2.4  Western blot检测                             24 h，收集细胞培养的上清液，使用乳酸检测试剂盒
                  将组织或收集的细胞裂解，离心取上清。使用                          检测上清液中乳酸的量。
              BCA 蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量。将上样                           1.2.9  ROS检测
              缓冲液与蛋白样品混匀，95 ℃加热 10 min，蛋白充                           将A549细胞接种到6孔板，首先阳性对照组加
              分变性后置于冰上，并逐一上样。将 20 μg 蛋白质                        入ROS up处理30 min，随后所有细胞均加入DCFH⁃DA
              在10%或15% SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，调                       荧光探针孵育，30 min 后弃培养液，用 PBS 洗两
              节电压至80 V，待样品进入分离胶后，换成120 V继                       遍，细胞重悬于 0.5 mL PBS 并转移到 EP 管中，取
              续；电泳结束后，转移到PVDF膜上，PVDF膜用甲醇                        100 μL加入到酶标板中，用荧光酶标仪检测。剩余
              激活后，按顺序放在转膜夹中，在 4 ℃、90 V、2 h 的                    的细胞悬液裂解后测蛋白浓度，最后ROS用蛋白浓
              条件下转膜。用 5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，用 5%                       度校准。
              BSA 配制一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，回收抗体，                   1.3  统计学方法
              洗膜，在室温下与二抗孵育 1 h，回收二抗，洗膜。                              数据均使用 Graphpad Prism 6 软件进行统计
              ECL发光液均匀滴加在PVDF膜上，曝光。                             分析，并作图。所示数据以均数±标准差（x ± s）表
              1.2.5  HE染色                                       示。组间比较采用 t 检验，P < 0.05 为差异有统计
                  小鼠麻醉后颈椎脱臼法牺牲小鼠，打开胸腔取                          学意义。
              出肺脏，随后将肺组织固定在 4%多聚甲醛中，48 h                        2 结     果
              后进行修块、脱水、包埋，制好切片标本。切片在
              二甲苯中脱蜡并使用梯度乙醇再水合，蒸馏水洗                             2.1  CC10rtta⁃KRAS/ALCAT1 KO 小鼠肺癌模型的
              3 min，苏木素染细胞核 1 min，水洗 5 min，酒精盐                  构建
              酸分色（1%的盐酸加入 70%乙醇中）数秒，快速                               四环素操纵子（TetO）调节的KRAS（TetO⁃KRAS）
              放入水中，再用流水冲洗蓝化 5 min，伊红染细胞质                        小鼠与Clara 细胞分泌蛋白（CC10）反向四环素反式
              1~2 min，复水透明，中性树脂封片，镜下拍照。                         激活因子（rtta）即 CC10rtta 小鼠杂交，当多西环素
              1.2.6  RT⁃PCR                                     饮食时，KRAS⁃G12D 位点被激活，在呼吸道上皮
                  肺组织加入 TRIzol 匀浆，离心取上清，提取                      细胞特异性表达诱导肺腺癌模型                  ［21］ 。为了验证
              RNA。 使 用 HiScript Ⅱ Q RT SuperMix 将 提 取 的         ALCAT1 基因的缺失是否可以缓解 KRAS 诱导的肺
              RNA逆转录为cDNA，将cDNA稀释至100 ng/μL，使                   腺癌的发生，本研究将 ALCAT1 基因表达缺失的小
              用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 进行RT⁃PCR扩增            鼠（ALCAT1 KO）与 CC10rtta⁃KRAS 小鼠杂交，最终
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