Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第8期
               ·1074 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


                  核定位信号（nuclear localization sequence，NLS）      剂盒（上海Omega Bio⁃tek公司），HA抗体（Abmart公
              是蛋白质实现核转位的重要结构域，通常由 4~8 个                         司，美国），Tublin 抗体、VDR 抗体（Santa Cruz 公司，
              氨基酸组成的短序列，含有Pro、Lys和Arg。有研究                       美国），HRP 标记抗兔 IgG 抗体、HRP 标记抗鼠 IgG
              表明，VD 在细胞内主要通过激活 VDR 发生核转位                        抗体（Jackson Immune Research 公司，美国），LaminB
              发挥转录因子功能         ［8-9］ ，VDR核定位信号可能位于两             抗体、Tris⁃HCl pH 8.8、Tris⁃HCl pH 6.8、抗荧光猝灭
              个锌指结构之间，其氨基酸序列与核定位相关                     ［10-11］ ，  剂、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（上海碧
              但缺乏精确定位和实验鉴定。研究表明，VDR在胞                           云天技术有限公司），组织固定液（武汉赛维尔生物

              质中也发挥功能，它能与IKKβ相互作用并抑制NF⁃                         科技有限公司），Poly⁃JET（济南Signa⁃Gen），GAPDH
              κB的激活    ［12］ 。因此，VDR的生物学功能与其细胞定                  抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），所有引物由南
              位密切相关，确定 VDR 的 NLS 对深入了解 VDR 信                    京金斯瑞公司合成。SYBR Green QPCR 试剂盒、逆

              号具有重要意义。本研究采用软件分析预测 NLS                           转录酶试剂盒、点突变试剂盒（Mut Express Ⅱ Fast
              并进行点突变验证，确定了VDR的NLS序列及其对                          Mutagenesis Kit V2）（南京诺唯赞生物科技有限公
              VDR 活性的影响，为 VD 及 VDR 的入核信号通路的                     司）。
              调控提供理论依据。                                              pCMV ⁃ HA ⁃ VDR 质 粒 由 本 实 验 室 提 供     ［6］ ，
                                                                HEK293T和HeLa细胞来自美国ATCC。
              1  材料和方法
                                                                1.2  方法
              1.1 材料                                            1.2.1 引物的设计
                  VD 由美国芝加哥大学 Yanchun Li 教授赠送。                       对质粒引入单碱基或多碱基的定点突变，引物
              胰酶、胎牛血清（Gibco 公司，美国），PVDF 膜（Bio⁃                  设计如表 1，采用点突变试剂盒在质粒 pCMV⁃HA⁃
              Rad公司，美国），Triton X⁃100 、Tris、NP40、甘油和吐            VDR 上构建了突变体 HA⁃VDR（R49W/R50G）、HA⁃
              温20（合肥Biosharp公司），NaCl、KCl、EDTA（上海凌               VDR（K53Q/R54G/K55EP）、HA⁃VDR（R49W/R50G/
              峰化学试剂有限公司），胶回收试剂盒、质粒小提试                           K53Q/R54G/K55E）。

                                                    表1  VDR基因点突变引物
                                             Table 1  VDR gene point mutation primers
                            引物名称                                         引物序列（5′→3′）
                 R49W/R50G上游引物                      AAAGGCTTCTTCTGGCGAAGCATGAAGCGGAAGGCACTATTCACC
                 R49W/R50G下游引物                      TCGCCAGAAGAAGCCTTTGCAGCCTTCACAGGTCATAGCATTGAAGTGA
                 K53Q/R54G/K55E上游引物                 AGCGGAAGGCACTATTCACCTGCCCCTTCAACGGGGA
                 K53Q/R54G/K55E下游引物                 TGAATAGTGCCTTCCGCTGCATGCTTCGCCTGAAGAAGCCTTTGC
                 R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E上游引物       TTCTGGCGAAGCATGCAGCGGAAGGCACTATTCACCTGCCCCTTC
                 R49W/R50G/K53Q/R54G/K55E下游引物       TGCATGCTTCGCCAGAAGAAGCCTTTGCAGCCTTCACAGG


              1.2.2 实时荧光定量PCR分析                                             表2   实时荧光定量PCR引物
                  在质粒转染及 VD 刺激后，收集 HeLa 细胞，采                     Table 2 Real⁃time fluorescent quantitative PCR primers
              用 TRIzol 试剂提取总RNA，并根据逆转录酶试剂盒                            引物名称                引物序列（5′→3′）
                                                                 hCYP24A1上游引物       GGTGGCGAGACTCAGAACG
              说明书将其逆转录为 cDNA，然后采用 SYBR Green
                                                                 hCYP24A1下游引物       GTCGTGCTGTTTCTTGAGACC
              QPCR 试剂盒，在 StepOnePlus（Applied Biosystems）
                                                                 hATP2B1上游引物        TGAAGGAGCTGCAATCCTCTT
              上分析cDNA，进行靶基因的扩增（表2）。
                                                                 hATP2B1下游引物        TGACCACCCCTGATGACAGT
              1.2.3 VDR的亚细胞定位分析
                                                                 hCYP27A1上游引物       CGGCAACGGAGCTTAGAGG
                  HEK293T 细胞进行质粒转染，经 VD 处理后收                     hCYP27A1下游引物       GGCATAGCCTTGAACGAACAG
              集细胞。采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂                              hGAPDH上游引物         GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
              盒分别获得胞质和胞核组分，点样10%聚丙烯酰胺                            hGAPDH下游引物         GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
              凝胶（SDS⁃PAGE）进行电泳分离，再经湿转法将蛋
              白转移到PVDF膜上，进行5%BSA室温封闭1 h。一                       抗分别采用VDR、Tubulin和Lamin B 抗体，4 ℃孵育
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